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摘要
目的探讨CD137-CD137配体(CD137L)信号通路是否通过c-Jun氨基末端激酶(JNK)途径影响小鼠血管平滑肌细胞(VSMC)自噬。方法采用组织块贴壁法进行C57BL/6J小鼠胸主动脉VSMC原代培养,取分离培养的第3～5代VSMC进行实验。实验分为4组,即对照组、CD137激动组[加入CD137L重组蛋白(终浓度10μg/ml)]、JNK抑制组[予JNK抑制剂SP600125(DMSO溶解,终浓度10μmol/L)预处理细胞30 min,然后再加入CD137L重组蛋白(终浓度10μg/ml)]和DMSO组[加入与JNK抑制组等量二甲基亚砜(DMSO)预处理30 min,然后加入CD137L重组蛋白(终浓度10μg/ml)]。Western blot法检测各组VSMC磷酸化JNK(p-JNK)、微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)及p62蛋白的表达水平。自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)荧光显微镜观察各组VSMC自噬流变化。透射电镜观察各组VSMC内自噬小体及自噬溶酶体变化。结果 (1)各组VSMCp-JNK、LC3Ⅱ和p62蛋白表达水平:CD137激动组VSMC p-JNK、LC3Ⅱ和p62蛋白表达水平均明显高于对照组(分别为1.15±0.19比0.72±0.21、1.03±0.13比0.59±0.15、1.10±0.19比0.76±0.15,P均<0.05)。JNK抑制组p-JNK、LC3Ⅱ和p62蛋白表达水平均低于CD137激动组(分别为0.61±0.21比1.15±0.19、0.74±0.11比1.03±0.13、0.21±0.12比1.10±0.19,P均<0.05)。DMSO组p-JNK、LC3Ⅱ和p62蛋白表达水平与CD137激动组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。(2)各组VSMC自噬流:CD137激动组VSMC内荧光斑点总数和黄色荧光点数均多于对照组[分别为(93.00±14.11)个/细胞比(52.33±9.61)个/细胞和(64.33±6.81)个/细胞比(25.67±3.51)个/细胞,P均<0.05],且CD137激动组VSMC内黄色荧光斑点数多于红色[分别为(64.33±6.81)、(28.67±7.51)个/细胞]。而JNK抑制组VSMC内光斑点总数和黄色荧光点数均少于CD137激动组[分别为(53.00±3.17)个/细胞比(93.00±14.11)个/细胞、(15.33±4.51)个/细胞比(64.33±6.81)个/细胞,P均<0.05],JNK抑制组VSMC内红色荧光斑点数多于黄色[分别为(37.67±4.73)、(15.33±4.51)个/细胞]。DMSO组荧光斑点总数和黄色荧光点数与CD137激动组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。(3)各组VSMC自噬小体及自噬溶酶体:CD137激动组VSMC内自噬小体和自噬溶酶体总数多于对照组[(17.67±6.03)个/细胞比(5.67±2.52)个/细胞,P<0.05],且自噬小体的水平较高、自噬溶酶体的水平较低。JNK抑制组VSMC内自噬小体和自噬溶酶体总数少于CD137激动组[(5.67±4.04)个/细胞比(17.67±6.03)个/细胞,P<0.05],且自噬溶酶体的水平较高、自噬小体的水平较低。DMSO组VSMC内自噬小体和自噬溶酶体总数与CD137激动组比较,差异无统计学意义(P>0.05),且均为自噬小体的水平较高、自噬溶酶体的水平较低。结论 CD137-CD137L信号通路可能通过JNK途径影响小鼠VSMC自噬。
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单位江苏大学附属医院
