APE-1 shRNA与过表达载体的构建及其对肝细胞免疫炎性因子、细胞凋亡的影响

作者：朱昱冰; 孙志鹏; 阿民布和; 樊庆; 吴广东; 张能维^*

来源：华中科技大学学报(医学版), 2019, 48(02): 137-142.

• 肝移植
• 免疫耐受
• APE-1
• 小发卡RNA
• 细胞凋亡

目的探究脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(apurinic-apyrimidinic endonuclease 1,APE-1)小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)与过表达载体构建及对肝细胞免疫炎性因子表达、细胞凋亡的影响。方法基于基因表达数据库GEO获取肝移植免疫耐受患者及非耐受患者外周血基因表达谱数据,通过R语言程序分析差异表达基因,获得肝移植免疫耐受相关基因APE-1。构建4个平行APE-1 shRNA载体(APE-1 shRNA1,APE-1 shRNA2,APE-1 shRNA3,APE-1 shRNA4),经质粒测序、Real-time PCR检测mRNA表达、Western blot检测蛋白表达筛选沉默效果最优的APE-1 shRNA。同理构建并鉴定APE-1过表达载体。STRING网站预测APE-1蛋白互作网络。利用构建的APE-1 shRNA和过表达载体,干预人正常肝细胞L-02的APE-1表达(分为对照组、APE-1沉默组和APE-1过表达组),ELISA法检测各组细胞炎性因子IL-1β、IL-10、TNF-α、INF-γ的表达情况,流式细胞术检测各组细胞凋亡变化。结果筛选获得35个肝移植免疫耐受相关显著差异表达基因,选取肝移植免疫耐受患者高表达基因APE-1。获得沉默效果最优APE-1 shRNA1载体及APE-1过表达载体。预测APE-1与ANP32A、FEN1、HMGB2、LIG1、MUTYH、NTHL1、OGG1、PCNA、POLB、SET等蛋白具有潜在相互作用。APE-1沉默导致L-02细胞(APE-1沉默组)炎性因子IL-1β、IL-10、TNF-α、INF-γ表达显著升高,细胞凋亡率显著增加;相反,APE-1过表达后(APE-1过表达组)L-02细胞炎性因子表达显著降低,细胞凋亡率显著降低。结论 APE-1表达可影响人正常肝细胞株L-02细胞炎性因子表达及细胞凋亡,这可能是肝移植免疫耐受中的关键基因。

• 单位
  北京大学; 首都医科大学附属北京世纪坛医院