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摘要
背景和目的中药十八反是中医界沿袭数千年的用药禁忌。有研究表明,甘草与反药合用前后对细胞色素P450具有不同的调控作用。令人感兴趣的是P-gp的底物特异性很大程度上与细胞色素P450同工酶(CYP3A1-3)相似,二者有很多重叠的底物。那么,这些反药对合用前后也有可能对肠粘膜P-gp产生不同的调节作用,这可能是反药合用引起临床上产生毒性的原因。文献检索表明,目前国内外尚未见由探讨肠粘膜P-gp的表达同中药配伍合理性之间的研究报告,因此探讨中药反药对合用后毒性增加是否同P-gp表达的改变等研究具有较高的学术价值。方法本课题选择十八反药对中的甘草和京大戟作为模型药进行研究。参考2010年版《中国药典》对所选中药材进行质量控制后,中药材按传统方法进行煎煮,制备甘草水提液,京大戟水提液及合煎水提液。选择典型的P-gp抑制剂维拉帕米为阳性对照药物,以生理盐水为阴性对照药物。将中药水提液,维拉帕米,生理盐水分别对Wistar大鼠灌胃造模,利用体外扩散池法(Ussingchamber),Real-timePCR法,在体Insitu实验法,分析甘草与京大戟合用前后对大鼠肠粘膜P-gp表达的影响。实验中,将P-gp典型底物药物罗丹明123(R123)和旁细胞途径药物荧光素钠(CF)分别作为转运方式的标志物进行检测。Ussingchamber体外实验中,R123和CF都具有可见光范围的荧光,故应用荧光分光光度计进行检测,检测灵敏度高。实验成功建立了荧光分光光度计对肠粘膜透过液中R123和CF检测的方法学,选取了灌胃的最佳浓度及能够反应肠道吸收机制的最佳肠段。Insitu体内实验中,应用LC-MS/MS首次建立了大鼠血浆中检测R123的方法学,期望通过对R123及CF的检测能间接地说明甘草反药合用前后对P-gp调控的规律性。基因水平实验中,选择mdr1a为目的基因,各个组织中表达量相对恒定的β-actin为内参基因分析造模大鼠不同区段肠道的P-gp表达情况,阐明甘草京大戟合用引起毒性增加的可能作用机制。结果实验用甘草水提液中所含甘草苷的量为0.6%,甘草酸的量为2.2%,均大于药典规定的含量。实验首次对京大戟进行含量测定,京大戟水提液中含大戟二烯醇的量为0.1%,丹酚酸B的量为2.0%。生理盐水组,R123在空肠回肠结肠中的分泌方向转运大于吸收方向转运,表明其在小肠中的转运是以分泌为主,说明泵出系统的存在。维拉帕米组,R123在空肠回肠结肠中的吸收方向转运大于分泌方向,表明其口服后,可显著抑制P-gp的表达,使R123在小肠中的转运是以吸收为主。不同浓度的甘草水提液或京大戟水提液灌胃后,R123在吸收方向与分泌方向的透过与生理盐水组比较,没有显著性差异。对CF经各区段肠粘膜透过性同样没有显著差异。但是,两者合用后,可以显著增加R123在吸收方向的透过同时降低在分泌方向的透过,而对CF的透过均没有显著影响。基因水平实验中,考察发现,空白组空肠,回肠,结肠mdr1a表达依次升高,而维拉帕米组空肠,回肠,结肠mdr1a表达,依次降低。甘草或京大戟组同空白组比较无显著差异,但是,合用组可以显著降低mdr1a的表达,差异具有统计学差异。实验发现甘草组或京大戟组R123最高血浆浓度Cmax、曲线下面积AUC0-240min和生物利用度F与对照组比较无统计学差异,而合并组Cmax、AUC0-240min和F均大于对照组(P<0.01),差异有统计学意义(P<0.01);但合并组对CF的各药动学参数与对照组比较无统计学差异。结论甘草京大戟合用后与单用组比较,可以显著抑制P-gp的功能和表达,我们可以推断甘草与京大戟配伍有毒,可能是合用后,甘草使京大戟中某些属于p-gp底物的有毒成分的分泌减少,吸收增加而导致其产生毒性作用;从另一方面考虑,京大戟也有可能使甘草中一些有毒的物质(P-gp底物)吸收增加。这些推测有待于未来的进一步实验。
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