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摘要
目的探讨胃癌患者血清外泌体对胃癌细胞AGS顺铂耐药、克隆形成、迁移、侵袭和凋亡的影响, 并探讨其分子机制。方法分离胃癌患者血清外泌体, qRT-PCR检测血清外泌体中lncRNA HOTTIP的表达。体外培养正常胃上皮细胞株GES1、胃癌细胞株AGS、人胚肾细胞株293T。AGS细胞与外泌体(Exo)孵育, 以PBS处理作为对照, 随后转染si-NC或si-HOTTIP-3, 设为Exo组、PBS组、si-NC+Exo组、si-HOTTIP-3+Exo组。AGS细胞分别转染si-NC、si-HOTTIP-1、si-HOTTIP-2、si-HOTTIP-3、oe-HOTTIP、vector、oe-HOTTIP+miR-138-5p mimic、oe-HOTTIP+mimic NC、miR-138-5p inhibitor、inhibitor NC、miR-138-5p inhibitor+si-TJP1及miR-138-5p inhibitor+si-NC, 设为si-NC组、si-HOTTIP-1组、si-HOTTIP-2组、si-HOTTIP-3组、oe-HOTTIP组、vector组、oe-HOTTIP+miR-138-5p mimic组、oe-HOTTIP+mimic NC组、miR-138-5p inhibitor组、inhibitor NC组、miR-138-5p inhibitor+si-TJP1组及miR-138-5p inhibitor+si-NC组。293T细胞转染mimic NC+HOTTIP wt、miR-138-5p mimic+HOTTIP wt、mimic NC+HOTTIP mut、miR-138-5p mimic+HOTTIP mut、mimic NC+TJP1 3’’UTR wt、miR-138-5p mimic+TJP1 3’’UTR wt、mimic NC+TJP1 3’’UTR mut、miR-138-5p mimic+TJP1 3’’UTR mut分别设为mimic NC+HOTTIP wt组、miR-138-5p mimic+HOTTIP wt组、mimic NC+HOTTIP mut组、miR-138-5p mimic+HOTTIP mut组、mimic NC+TJP1 3’’UTR wt组、miR-138-5p mimic+TJP1 3’’UTR wt组、mimic NC+TJP1 3’’UTR mut组、miR-138-5p mimic+TJP1 3’’UTR mut组。CCK8实验检测细胞的顺铂敏感性, 平板克隆检测细胞克隆形成, Transwell实验检测细胞迁移和侵袭, 流式细胞仪检测细胞凋亡, Western blot实验检测外泌体标志蛋白CD63和CD81、TJP1及耐药相关蛋白P-gp、MCL-1的表达, 双荧光素酶实验验证lncRNA HOTTIP、miR-138-5p和TJP1之间的靶向关系。观察指标:(1)lncRNA HOTTIP的表达情况。(2)血清外泌体介导lncRNA HOTTIP对胃癌细胞顺铂的耐药情况。(3)过表达lncRNA HOTTIP通过miR-138-5p对胃癌细胞顺铂耐药的调控情况。(4)miR-138-5p靶向TJP1 3′非编码区检测情况。(5)抑制miR-138-5p通过TJP1对胃癌细胞顺铂耐药的调控情况。正态分布的计量资料以x±s表示, 组间比较采用t检验, 多组间比较采用单因素方差分析, 进一步两两比较采用Tukey′s检验。计数资料以绝对数表示, 组间比较采用χ2检验。相关性分析采用Pearson检验。结果 (1)lncRNA HOTTIP的表达情况。lncRNA HOTTIP在胃癌患者血清外泌体中的表达高于在健康志愿者血清外泌体中的表达, 差异有统计学意义(P<0.05)。透射电子显微镜结果显示:血清外泌体呈圆形或卵圆形;Western blot检测结果显示:血清外泌体中存在标志性蛋白CD63和CD81的表达。(2)血清外泌体介导lncRNA HOTTIP对胃癌细胞顺铂的耐药情况。与PBS组比较, Exo组半抑制浓度(IC50)、细胞克隆形成数、侵袭细胞数、迁移细胞数、P-gp蛋白表达和MCL-1蛋白表达均升高, 细胞凋亡率降低, 差异均有统计学意义(P<0.05)。与si-NC+Exo组比较, si-HOTTIP-3+Exo组IC50、细胞克隆形成数、侵袭细胞数、迁移细胞数、P-gp蛋白表达和MCL-1蛋白表达均降低, 细胞凋亡率升高, 差异均有统计学意义(P<0.05)。(3)过表达lncRNA HOTTIP通过miR-138-5p对胃癌细胞顺铂耐药的调控情况。与vector组比较, oe-HOTTIP组IC50、细胞克隆形成数、侵袭细胞数、迁移细胞数、P-gp蛋白表达和MCL-1蛋白表达均升高, 细胞凋亡率降低, 差异均有统计学意义(P<0.05)。与oe-HOTTIP+mimic NC组比较, oe-HOTTIP+miR-138-5p mimic组IC50、细胞克隆形成数、侵袭细胞数、迁移细胞数、P-gp蛋白表达和MCL-1蛋白表达均降低, 细胞凋亡率升高, 差异均有统计学意义(P<0.05)。(4)miR-138-5p靶向TJP1 3′非编码区检测情况。双荧光素酶实验显示:mimic NC+TJP1 3′UTR wt组、miR-138-5p mimic+TJP1 3′UTR wt组的荧光素酶活性分别为1.00±0.09、0.21±0.03, 差异有统计学意义(t=15.02, P<0.05)。(5)抑制miR-138-5p通过TJP1对胃癌细胞顺铂耐药的调控情况。与inhibitor NC组比较, miR-138-5p inhibitor组IC50、细胞克隆形成数、侵袭细胞数、迁移细胞数、P-gp蛋白表达和MCL-1蛋白表达均升高, 细胞凋亡率降低, 差异均有统计学意义(P<0.05)。与miR-138-5p inhibitor+si-NC组比较, miR-138-5p inhibitor+si-TJP1组IC50、细胞克隆形成数、侵袭细胞数、迁移细胞数、P-gp蛋白表达和MCL-1蛋白表达均降低, 细胞凋亡率升高, 差异均有统计学意义(P<0.05)。结论血清外泌体介导lncRNA HOTTIP通过调控胃癌细胞中miR-138-5p/TJP1的表达, 促进胃癌细胞的顺铂耐药性、克隆形成、迁移和侵袭, 抑制细胞凋亡。
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单位河南省人民医院
