小鼠血管壁CD34+干细胞的分离、培养及鉴定

作者：杨礼菊; 马颖; 李源; 党青亚; 程俊; 杨艳; 李鹏云^*

来源：生理学报, 2023, 75(02): 205-215.

DOI：10.13294/j.aps.2023.0016

• 血管壁干细胞
• 细胞分离
• 细胞鉴定
• 磁珠分选

血管壁干细胞(vascular wall-resident stem cells, VW-SCs)在维持血管正常功能以及损伤血管的修复过程中发挥着关键性的作用，对其功能特性的研究将有助于干细胞的调控及应用。本文旨在建立稳定的VW-SCs分离、培养及分选鉴定技术，为进一步深入研究VW-SCs在生理和疾病状态下的增殖、迁移和分化等机制提供丰富、可靠的细胞来源。首先利用组织块贴壁法获取小鼠主动脉外膜以及肠系膜动脉血管壁细胞，传代培养到细胞数量至少达到1×107后经磁珠分选和流式细胞术鉴定CD34+的VW-SCs；其次采用细胞免疫荧光染色检测干细胞标志物(CD34、Flk-1、c-kit、Sca-1)以及平滑肌标志物(SM22、SM MHC)、内皮标志物(CD31)和细胞核内分裂增殖相关蛋白(Ki-67)；血管壁CD34+干细胞的定向分化采用EBM-2内皮分化诱导培养基和FM-2成纤维细胞培养基分别培养7天和3天；利用细胞免疫荧光染色和q-PCR检测内皮细胞标志物(CD31, VWF)和成纤维细胞标志物(Vimentin, PDGFRα)的表达。此外，采用TILLvisION胞内钙信号检测系统结合Ca2+荧光探针Fura-2/AM观察CD34+干细胞胞内钙库Ca2+释放和胞外Ca2+内流特性。结果显示，血管组织块贴壁法和磁珠分选可获取较高纯度(> 90%)的小鼠主动脉外膜以及肠系膜动脉血管壁CD34+干细胞。体外培养的血管壁CD34+干细胞可诱导分化为内皮细胞和成纤维细胞。咖啡因和ATP可显著激活CD34+干细胞胞内钙库Ca2+释放，毒胡萝卜素(thapsigargin, TG)耗竭内质网钙库Ca2+后触发钙库操纵的外钙内流(store-operated Ca2+entry, SOCE)。该方法建立了稳定、高效的血管壁CD34+干细胞分离、培养和鉴定技术，为体外深入研究VW-SCs的调控机制以及靶向药物的筛选提供了保障。

• 单位
  西南医科大学