科研之友
微信
新浪微博
Facebook
分享链接
摘要
为制备非洲猪瘟病毒（ASFV）A137R蛋白鼠源单克隆抗体（MAb），本研究通过原核系统表达并纯化了重组A137R(rA137R)，将其免疫BALB/c小鼠并通过间接ELISA方法筛选到2株能够稳定分泌A137R MAb的杂交瘤细胞株3D1和2C3。亚类试剂盒鉴定结果显示，两株MAb重链亚类均为IgG1，轻链亚类均为Kappa链。采用间接ELISA方法测得MAb 3D1和2C3的腹水效价均高于105，选取效价较高的MAb 3D1用于后续试验。采用western blot检测制备的MAb 3D1与293T细胞中过表达的A137R（不同剂量）及ASFV感染猪肺泡巨噬细胞（PAMs）后（感染后不同时间）天然表达的A137R的反应性；采用间接免疫荧光试验（IFA）检测MAb 3D1与293T细胞中过表达的A137R的反应性。Western blot结果显示，过表达A137R的293T细胞出现了15 ku左右的特异性条带，且随着转染质粒量浓度的增加，蛋白表达量增加；感染ASFV的PAMs中（感染后8 h）出现了15 ku左右的特异性条带，且随着感染时间的延长，蛋白表达量增加。IFA结果显示，在过表达A137R的293T细胞中出现绿色荧光。以上结果表明，制备的MAb 3D1既能够与过表达的A137R反应，也能够与天然表达的A137R反应，反应性较强。将MAb 3D1用于激光共聚焦试验中检测ASFV感染PAMs后不同时间A137R的细胞定位；用于免疫共沉淀（Co-IP）试验中检测293T细胞中过表达的A137R和Flag-Agarose结合的反应性。激光共聚焦试验结果显示，ASFV感染PAMs后6 h出现绿色荧光，且荧光主要在细胞质中，随着感染时间的延长，绿色荧光逐渐增多增强，表明A137R主要定位于细胞质中。Co-IP试验结果显示，MAb 3D1可以检测到结合在Beads上的A137R，出现约15 ku的特异性条带，表明MAb 3D1可以用于Co-IP试验。利用一系列表达部分重叠的重组A137R片段并经western blot鉴定两株MAb识别的表位；根据western blot结果合成一系列多肽并包被ELISA板，采用间接ELISA方法进一步筛选MAb识别的抗原表位，并利用western blot验证筛选到的抗原表位。结果显示，A137R氨基酸序列中的18NFHRCAWEE26和64AWHEVPECREFI75分别为MAb 3D1和2C3的抗原表位。本研究首次制备了ASFV A137R蛋白的MAb，并进行了初步应用研究，还对其进行了表位鉴定，为进一步将该MAb利用于ASFV的检测和疫苗研究提供了实验依据。
-
单位动物科学学院; 长江大学; 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所; 兽医生物技术国家重点实验室
