溶血性曼氏杆菌截短型白细胞毒素的原核表达及多克隆抗体制备

作者：宋越; 苏胜杰; 张帆; 白帆; 戴伶俐; 王娜; 王大伟; 杨茜雯; 赵世华; 张月梅^*

来源：中国畜牧兽医, 2023, 50(06): 2479-2486.

DOI：10.16431/j.cnki.1671-7236.2023.06.032

• 截短型蛋白
• 原核表达载体
• 毒力因子
• 致病机理

【目的】构建溶血性曼氏杆菌截短型白细胞毒素(LktA)原核表达系统，表达融合蛋白并进行纯化和鉴定，为溶血性曼氏杆菌检测方法的建立提供物质基础。【方法】设计并合成特异性引物，PCR扩增羊溶血性曼氏杆菌lkta截短基因；用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ对PCR产物和pET-28b(+)载体进行双酶切，用T4 DNA连接酶将溶血性曼氏杆菌lkta截短基因克隆到pET-28b(+)载体；使用IPTG诱导融合蛋白LktA的表达。通过Ni2+亲和层析纯化后采用SDS-PAGE和Western blotting对融合蛋白进行鉴定。用融合蛋白LktA免疫4月龄健康雌性新西兰大白兔制备多克隆抗体，4次免疫完成后进行抗体效价测定。【结果】测序结果表明，构建的表达载体中溶血性曼氏杆菌lkta基因序列正确；融合蛋白LktA的分子质量约为30 ku,在大肠杆菌中高效表达并以包涵体形式存在，在变性条件下纯化融合蛋白LktA电泳图显示条带单一，确定其纯度>90%;纯化的融合蛋白LktA可与His抗体进行特异性结合。将纯化的融合蛋白LktA免疫新西兰大白兔后成功制备出多克隆抗体，抗体效价达1∶256 000以上。【结论】本研究成功构建了羊溶血性曼氏杆菌截短型LktA的原核表达载体并制备其多克隆抗体，为后期溶血性曼氏杆菌检测方法的建立提供试验材料。

• 单位
  内蒙古自治区动物疫病预防控制中心; 内蒙古自治区农牧业科学院