携带人AKT2、PDK1、BAD基因的慢病毒表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

作者：朱静; 陈勃江; 黄娜; 李为民

来源：四川大学学报（医学版）, 2014, 45(02): 299-303.

• AKT2
• BAD
• PDK1
• 慢病毒载体
• 绿色荧光蛋白
• 非小细胞肺癌

目的构建含人丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/AKT2)、磷酸肌醇依赖激酶-1(phosphoinositide-dependent kinase 1,PDK1)、bcl-2相关性死亡蛋白(bcl-2-associated death protein,BAD)基因的绿色荧光慢病毒载体,鉴定其在293T细胞中的表达。方法选择病理证实的非小细胞肺癌(NSCLC)组织,采用特异性引物RT-PCR扩增AKT2、PDK1及BADcDNA。将PCR产物与T载体连接测序,测序正确的目的片段从T载体上酶切下与慢病毒骨架质粒连接,将此重组的慢病毒表达载体质粒及包装系统共转染入293T细胞(人胚肾细胞系),收集病毒上清,Western blot检测AKT2,BAD及PDK1蛋白质表达。结果凝胶电泳证实AKT2,BAD,PDK1三基因成功转导至以pCDF1-MCS2-EF1-copGFP为骨架质粒的慢病毒包装系统中,磷酸钙转染法72h后BAD、PDK1及AKT2的转染率分别约为100%、95%、90%。慢病毒包装后测定3种病毒滴度均达6.7×106PFU/mL,并通过Western blot法检测到AKT2,BAD,PDK1蛋白在293T细胞的表达。结论成功构建了携带人AKT2、BAD、PDK1原癌基因的慢病毒表达载体,在293T细胞中成功鉴定其表达。

• 单位
  四川大学华西医院; 绵阳市中心医院; 成都医学院第一附属医院