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摘要
为了建立新型鸭细小病毒(novel duck Parvovirus, NDPV)感染鸭群的抗体检测方法,试验采用PCR方法扩增新型鸭细小病毒的VP2基因,将其克隆至pET-32a(+)载体中,获得重组质粒pET-32a(+)-VP2;将该重组质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,经优化诱导表达后通过SDS-PAGE电泳分析表达产物,并对表达的蛋白质进行纯化、复性;再利用阳性血清对表达的蛋白质进行Western-blot鉴定;以纯化的重组蛋白作为抗原包被ELISA酶标板,通过优化抗原包被量、一抗稀释度、抗原封闭条件、一抗和二抗的孵育条件等最终建立间接ELISA方法,并对该方法进行评定。结果表明:成功构建出NDPV重组VP2蛋白,在37℃、1.0 mmol/L IPTG条件下诱导5 h的表达量最大,蛋白质的分子质量约为49 ku,主要以不溶性的包涵体形式存在。纯化、复性后的重组VP2蛋白浓度为2.378 mg/mL,纯度为97%。Western-blot鉴定得到的条带单一,大小为49 ku。间接ELISA检测方法的最佳抗原包被量为200 ng/孔,一抗稀释度为1∶200;其他检测条件最优结果为4℃包被过夜,37℃封闭2 h,一抗37℃孵育1 h,二抗稀释10 000倍,二抗37℃孵育1 h。间接ELISA检测方法的检测临界值为0.445,该方法具有较好的特异性、敏感性和重复性,对临床样品的阳性检出率为93.3%。说明以重组VP2蛋白为包被抗原建立的间接ELISA检测方法效果良好,为临床NDPV的感染提供了一种新的检测方法。
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