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摘要
选取大肠杆菌毒力基因escV、stx2和hlyA为靶标序列构建质粒标准品,快速检测大肠杆菌。通过菌落聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和测序对所构建的重组质粒进行验证,传15代测序验证质粒稳定性。制备escV、stx2、hlyA质粒标准品,对标准品进行检测限、均匀性、稳定性和定性实验。然后利用escV、stx2和hlyA质粒标准品对枸杞子中大肠杆菌进行检测。通过菌落PCR和测序结果表明escV、stx2和hlyA标准品制备成功。PCR体系对质粒标准品检测灵敏度达pg级别,并具有特异性,传15代测序的结果表明质粒标准品具有稳定性。escV、stx2和hlyA质粒标准品检测限分别为3.93×106、2.41×105拷贝/mL和2.14×105拷贝/mL,在25、4、-20℃条件下具有很好的稳定性和性质。escV、stx2和hlyA质粒标准品对34批枸杞子样品检测,escV、stx2没有被检测出,有3批枸杞子样品中检测出hlyA(检出率为8.82%)。参考GB 4789.6—2016《食品微生物学检验大肠菌群计数》方法结合16S rRNA测序对这3批枸杞子样品进行检测,结果没有检测出大肠杆菌,说明质粒标准品检测灵敏度高,相较于传统微生物分离鉴定,检出率有了很大的提高。
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