布鲁氏菌微滴式数字PCR方法的建立与应用

作者：田国忠; 姜海; 薛盼盼; 朴东日; 赵鸿雁; 杨晓雯; 张京云^*

来源：中国人兽共患病学报, 2021, 37(04): 301-305.

• 微滴式数字PCR
• 荧光定量PCR
• 布鲁氏菌

目的建立可对布鲁氏菌准确定量的微滴式数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)方法。方法使用以布鲁氏菌bscp31基因为靶标的引物和探针,摸索最佳的引物和探针工作浓度,确定反应体系和扩增条件,评价所建立方法的灵敏性、特异性及对疫情相关血液标本的检测效果。结果 ddPCR反应体系中最佳引物和探针浓度分别为0.8μmol/L和0.4μmol/L;最佳扩增条件:95℃10 min; 95℃30 s, 60℃1 min,循环40次;98℃酶失活10 min。布鲁氏菌核酸DNA为0.96 ng/反应～3.68 fg/反应时,ddPCR检出靶标基因拷贝数为2.00×105拷贝/反应～1拷贝/反应,ddPCR测得值的对数值与DNA浓度的对数值有线性关系。在疫情相关血液标本DNA的检测中,ddPCR阳性率远高于培养法和试管凝集法;16份人血液标本中靶标基因浓度为5～65拷贝/mL血液(平均29拷贝/mL血液),5份羊血液标本中靶标基因浓度为25～245拷贝/mL血液(平均98拷贝/mL血液)。结论 ddPCR灵敏性高,可检测微量核酸DNA,适合临床血液标本的检测以及布病病原体的分子流行病学调查。

• 单位
  中国疾病预防控制中心传染病预防控制所