鸡RIPK2基因慢病毒干扰载体的构建及稳定低表达RIPK2的HD11筛选

作者：孙红艳^*; 陈婷宏; 吴钰湘; 孙长花; 李欢^*

来源：农业生物技术学报, 2022, 30(06): 1031-1042.

• 鸡受体互作丝氨酸苏氨酸激酶2 (RIPK2)基因
• 小发卡RNA (shRNA)
• 慢病毒载体
• 鸡巨噬细胞系(HD11)

前期通过高通量测序发现，受体互作丝氨酸苏氨酸激酶2 (receptor interacting serine/threonine kinase 2, RIPK2)介导的NOD/RIPK2信号通路在鸡(Gallus gallus)免疫炎症反应过程中显著性富集。为研究RIPK2在鸡巨噬细胞系(chicken macrophage cell line, HD11)中免疫炎症的功能，本研究采用慢病毒(Lentivirus)介导的RNA干扰技术，建立了稳定干扰RIPK2基因表达的HD11。根据鸡RIPK2基因的序列，设计了3个RNA干扰靶点序列和1个阴性对照序列，连接到pLVshRNA-EGFP(2A)Puro干扰载体，瞬时转染HD11。利用qRT-PCR技术检测各靶点对RIPK2的干扰效率，将干扰效率最佳的重组载体进行慢病毒包裹。利用包裹干扰载体的慢病毒感染HD11，采用qRT-PCR及Western blot检测不同实验组中RIPK2及NOD/RIPK2信号通路下游关键基因：核因子-κB激酶复合物抑制剂(component of inhibitor of nuclear factor kappa B kinase complex, IKKα)、因子-κB激酶亚单位β抑制剂(inhibitor of nuclear factor kappa B kinase subunit beta, IKKβ)、核因子κB亚单位1 (nuclear factor kappa B subunit 1, NFκB)和白细胞介素1β(interleukin 1 beta, IL1β)的表达量变化。同时构建了RIPK2过表达载体(pcDNA3.1-RIPK2)，并以此载体开展RIPK2基因的拯救实验。构建了3条靶向RIPK2的慢病毒干扰表达载体RIPK2-shRNA1 (小发卡RNA1, short hairpin RNA 1)、RIPK2-shRNA2和RIPK2-shRNA3，其中RIPK2-shRNA1和RIPK2-shRNA3重组质粒对RIPK2基因的干扰效率分别为(77.4±0.61)%和(90.21±0.68)%。将RIPK2-shRNA3重组质粒进行慢病毒包裹，获得病毒滴度为2×108 TU/mL；将RIPK2-shRNA3慢病毒转染HD11，干扰组RIPK2 mRNA和蛋白表达水平较对照组显著性降低(P<0.05),NOD/RIPK2信号通路下游关键基因IKKα、IKKβ、NFκB和IL1β的表达量发生了显著下调(P<0.05)；干扰组转染RIPK2过表达载体(pcDNA3.1-RIPK2)后RIPK2的表达水平能够恢复。本研究成功构建了靶向鸡RIPK2的shRNA慢病毒表达载体，可有效沉默RIPK2基因在HD11中的表达，并且稳定表达RIPK2-shRNA3的HD11可干扰NOD/RIPK2信号转导，为进一步分析RIPK2参与的NOD/RIPK2信号通路的功能研究提供理论依据。

• 单位
  扬州大学; 扬州市职业大学