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摘要
1.目的肝脏纤维化是病毒性肝炎、酒精中毒、脂肪肝等各种慢性肝损伤的最终环节,是肝硬化发生、发展的病理基础。迄今为止,尚未找到一种特殊有效的治疗肝纤维化的药物。吡非尼酮是一种新的口服广谱抗纤维化小分子药物,其在欧洲和美国已经被批准应用于特发性肺纤维的临床治疗中,并取得了显著疗效。由于纤维化的发生具有相似的机制,所以人们将吡非尼酮其用于其他纤维化疾病的研究并取得了不错的疗效。而在肝纤维化治疗中,吡非尼酮的疗效及作用机制仍尚不明确。本实验拟探讨吡非尼酮在体外对活化的肝星形细胞的作用及吡非尼酮经灌胃、尾静脉注射、肝动脉和门静脉不同途径给药后,对二乙基亚硝胺诱导的大鼠肝纤维化模型的治疗作用及其机制,并筛选最佳给药途径,为临床应用奠定基础。2.方法2.1吡非尼酮对LX-2细胞细胞周期、细胞增殖、迁移和分化的影响:体外培养LX-2细胞株,细胞状态稳定后将LX-2细胞分为2组,即空白对照组和药物处理组。吡非尼酮作用于LX-2细胞24h后,流式细胞仪检测细胞周期、CCK-8法检测细胞增殖的变化,划痕愈合实验观察细胞迁徙能力的改变,免疫印迹法(Western Blot)检测吡非尼酮对MCP-1蛋白表达的影响及qrt-PCR检测吡非尼酮作用后胶原I表达的变化;2.2二乙基亚硝胺诱导SD大鼠肝纤维化模型,造模成功后,将大鼠随机分为6组,分别为(1)正常对照组(2)DEN模型对照组(3)吡非尼酮灌胃模型组(4)吡非尼酮经尾静脉给药模型组(5)吡非尼酮经肝动脉给药模型组(6)吡非尼酮经门静脉给药模型组。药物处理4周后抽取大鼠血清,检测天门冬氨酸转移酶(AST)和谷丙转移酶(ALT),麻醉处死各组动物模型,HE、Masson染色观察纤维化情况,Western Blot和qrt-PCR检测转化生长因子β1(TGF-β1)、信号转导分子7(Smad7)、MCP-1、基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)、胶原伴侣分子47(HSP47)和Collagen I表达情况。3.结果3.1吡非尼酮处理LX-2 24h后,G1期明显缩短,与对照组相比具有差异性(p<0.05)。明显抑制细胞增殖(p<0.05),并且这种抑制作用具有浓度依赖性(p<0.05);在0和24小时进行划痕愈合测定,结果表明与对照组相比,吡非尼酮以剂量依赖的方式明显抑制LX-2细胞的迁移能力(p<0.01);Western Blot结果表明:吡非尼酮明显抑制MCP-1蛋白的表达(p<0.05),并且这种抑制作用具有浓度依赖性(p<0.05);qrt-PCR结果表明:吡非尼酮明显抑制Collagen I(实验组/对照组)的表达(p<0.01),且抑制作用具有浓度依赖性(p<0.05)。3.2吡非尼酮经不同给药方式治疗DEN诱导的大鼠肝纤维化模型后:与DEN模型对照组相比,PFD处理的DEN模型组中ALT、AST均明显降低(p<0.05);HE、Masson染色观察:与DEN模型对照组相比,PFD可以明显改善DEN诱导的大鼠肝纤维化模型的肝组织的肝纤维化情况,并且经门静脉给药组效果最明显;qrt-PCR检测结果:与正常对照组相比,DEN诱导的模型组中TGF-β1、MCP-1、TIMP-1、MMP-2、Collagen I m RNA的表达明显增加(p<0.01);与DEN模型对照组相比,PFD灌胃组、PFD尾静脉组、PFD肝动脉组、PFD门静脉组TGF-β1、MCP-1、TIMP-1、MMP-2、Collagen I m RNA的表达均明显降低(p<0.05);其中在治疗组间,MMP-2 m RNA的表达在PFD灌胃组降低最显著(p<0.01),但与PFD门静脉组相比无统计学差异;TGF-β1、MCP-1、TIMP-1和Collagen I m RNA的表达则在PFD门静脉组降低最明显(p<0.01);Western Blot检测结果:(1)与正常对照组相比,DEN诱导的模型组中HSP47蛋白的表达明显增加(p<0.01);与DEN模型对照组相比,PFD灌胃组、PFD尾静脉组、PFD肝动脉组、PFD门静脉组HSP47蛋白的表达均明显降低(p<0.05),并且PFD肝动脉组和PFD门静脉组降低最明显(p<0.05),但两组之间无明显统计学差异;(2)与正常对照组相比,DEN诱导的模型组中Smad7蛋白的表达明显降低(p<0.01);与DEN对照组相比,PFD灌胃组、PFD尾静脉组、PFD肝动脉组、PFD门静脉组Smad7蛋白的表达均明显增加(p<0.05),并且PFD门静脉组Smad7蛋白表达增加最明显(p<0.05)。4.结论(1)吡非尼酮处理LX-2细胞后,该药物能明显影响LX-2细胞周期,抑制细胞增殖和迁移能力,并通过降低细胞外基质的表达,减轻细胞增殖纤维化。(2)经门静脉灌注PFD可以明显减轻DEN诱导的大鼠肝纤维化模型的肝脏炎症反应、保护肝细胞、降低纤维化程度。并通过下调TGF-β1、MCP-1、TIMP-1、MMP-2和HSP47细胞因子的表达以及上调Smad7的表达,抑制肝星形细胞的活化,阻止Collagen I的形成,延缓、逆转肝纤维化的形成。
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