CRISPR/Cas9介导获得用于分离双峰驼iPSCs的转染细胞系

作者：李宗帅; 申培磊; 刘雷雷; 杨洋; 李海江; 张全伟; 贡继尚; 赵兴绪; 张勇^*

来源：农业生物技术学报, 2019, 27(01): 180-190.

• 双峰驼
• CRISPR/Cas9
• 诱导性多功能干细胞(iPSCs)
• Nanog基因
• 报告基因

双峰驼(Camelus bactrianus)作为西北地区的濒危物种,其生理特性特殊,用途广泛。利用诱导性多功能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)对该物种的种质资源进行保护具有重要的应用价值。但传统分离鉴定iPSCs的方法较为复杂繁琐。为了对iPSCs进行快速高效的分离鉴定,本实验利用CRISPR/Cas9系统,参照双峰驼Nanog基因,在其终止密码子附近设计单链导向RNA (single guide RNA,sgRNA),成功构建了切割载体;以双峰驼全基因组为模板获得上、下游同源臂,并在两个同源臂之间连入两个报告基因绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein, GFP)和新霉素抗性基因(neomycin resistance,Neo),成功构建了表达载体。同时测得双峰驼胎儿成纤维细胞对于遗传霉素(geneticin, G418)的最小致死量。用表达载体与切割载体共转染双峰驼胎儿成纤维细胞,继续培养48 h后,用G418筛选两周;之后用不含G418的DMEM/F12完全培养基对药筛后的细胞进行扩大培养,成功获得了活力较高的稳定转染细胞系。本实验为验证在Nanog基因后定点敲入报告基因来正确筛选iPSCs提供了生物材料。

• 单位
  甘肃农业大学; 生命科学学院