LHRH介导的TAT蛋白核心肽PTD的制备及跨膜研究

作者：马洪圆; 岳玉环^*; 李泽鸿^*; 张国利; 田园; 吴广谋; 刘雨玲; 余晓颖; 杨雯棋; 陈云雨

来源：黑龙江畜牧兽医, 2019, (01): 8-175.

DOI：10.13881/j.cnki.hljxmsy.2018.03.0250

• 核心肽
• 转促黄体激素释放激素
• 目的蛋白
• 转导效率
• 绿色荧光
• 跨膜

为了研究促黄体激素释放激素(LHRH)介导的TAT蛋白核心肽PTD的跨膜作用,测定目的蛋白的转导效率,试验以pET28a-PTD-GFP质粒为模板,设计含LHRH基因序列的特异性PCR引物,经PCR扩增后双酶切,并克隆到原核表达载体pET28a中,构建重组质粒并在E.coli BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达,超声破碎后进行硫酸铵梯度沉淀,取上清液用Phenyl-HP疏水层析柱和Q阴离子交换层析柱纯化,将纯化后的目的蛋白加到体外培养的HeLa细胞中,观察转导情况,分析目的蛋白浓度对转导效率的影响。结果表明:PCR扩增得到目的基因LHRH-PTD-GFP,并成功构建出重组质粒pET28a-LHRH-PTD-GFP,在E.coli BL21(DE3)感受态细胞中成功诱导表达出目的蛋白,经Phenyl-HP疏水层析柱和Q阴离子交换层析柱成功纯化出目的蛋白,在荧光显微镜下HeLa细胞内显现明显的绿色荧光,经分析转导效率与目的蛋白浓度之间呈正相关,回归系数为0.096 6,决定系数(R2)为0.937 8。说明LHRH介导的TAT蛋白核心肽PTD具有很好的跨膜特性,转导效率对目的蛋白浓度具有依赖性,在一定浓度范围内随着目的蛋白浓度的增加转导效率增大。

• 单位
  皖南医学院; 生命科学学院; 吉林农业大学