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摘要
嗜热酸性Ⅲ型普鲁兰水解酶TK-PUL在液化条件下可完全水解淀粉为淀粉糖，在“液化糖化一步法”的淀粉制糖工艺中具有巨大的应用潜力。本研究拟采用易错聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术提高TK-PUL的催化活性。经过两轮易错PCR及高通量筛选，获得了催化活性提高的突变体L538D。与TK-PUL相比，L538D以可溶性淀粉为底物的比酶活力提高了50%，以普鲁兰多糖为底物的比酶活力提高了21%;L538D以可溶性淀粉、普鲁兰多糖为底物的kcat/Km值分别提高了44%、27%。即L538D的α-1,4-糖苷键水解活性和α-1,6-糖苷键水解活性均明显提高，并且其α-1,4-糖苷键水解活性的提高幅度更大。同源模建得到的蛋白质分子结构显示，将TK-PUL中Leu538替换为Asp，可能通过缩短氨基酸残基侧链的长度和减弱氨基酸残基的疏水性，提高了催化活性位点Glu538所在loop结构的柔性，从而提高酶的催化活性。本研究结果表明，TK-PUL中Leu538是影响其催化活性的重要氨基酸残基。
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