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摘要
由于目前用于小反刍兽疫病毒(PPRV)相关研究的羊源细胞均为原代细胞,其对PPRV的敏感性较差,而信号淋巴细胞激活分子(SLAM)作为PPRV的重要受体可以促进病毒的感染与复制。因此,为构建表达山羊SLAM(gSLAM)的重组腺病毒,为羊源原代细胞提供SLAM受体,本研究将gSLAM基因克隆至腺病毒穿梭载体pShuttleCMV中,转化至含有5型腺病毒骨架的BJ5183感受态细胞中,获得重组腺病毒载体pAd-gSLAM,转染293A细胞,经PCR鉴定表明获得了重组腺病毒rAd-gSLAM。以MOI 3 rAd-gSLAM感染Vero细胞后,采用western blot检测SLAM的表达。结果显示,rAd-gSLAM能够感染Vero细胞并表达SLAM蛋白。将PPRV疫苗株rPPRV/GFP和中国流行株PPRV/CN/HLJ/13分别以MOI 0.1感染rAd-gSLAM预先感染后的Vero(Vero/rAd-gSLAM)细胞,24 h经荧光显微镜观察,并采用荧光定量PCR检测两株病毒在感染后不同时间点的拷贝数,绘制病毒的生长曲线。荧光显微镜观察可见,rPPRV/GFP感染的Vero/rAd-gSLAM细胞出现较大量绿色荧光且形成明显的细胞融合;PPRV/CN/HLJ/13感染的Vero/rAd-gSLAM细胞形成明显的细胞融合且出现红色荧光。病毒的生长曲线结果显示,rPPRV/GFP在Vero/rAdgSLAM细胞中的拷贝数与其在Vero和Vero/Ad对照细胞中的拷贝数在感染后各时间点差异却均不显著;PPRV/CN/HLJ/13的拷贝数在感染Vero/rAd-gSLAM细胞后24 h即达到峰值,且其在感染该细胞后72 h的拷贝数约为其感染Vero及Vero/Ad细胞在该时间点的48倍。将rAd-gSLAM(MOI 3)感染原代羊源睾丸(LT)细胞后,再以MOI 0.1分别感染rPPRV/GFP和PPRV/CN/HLJ/13,72 h后经荧光显微镜观察可见,前者感染的LT细胞出现绿色荧光,且有明显的细胞融合;后者感染的LT细胞出现明显的细胞融合和CPE。上述结果表明,本研究构建了表达gSLAM的重组腺病毒rAd-gSLAM,其感染Vero细胞系和原代LT细胞后均能够表达gSLAM,增强了PPRV对Vero细胞系和原代LT细胞的感染与复制。本研究为PPRV在羊源细胞中的生长、复制研究提供了重要的工具,同时为其感染与免疫机制的研究奠定了基础。
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单位中国农业科学院哈尔滨兽医研究所; 兽医生物技术国家重点实验室
