溶血性曼氏杆菌PlpE基因原核表达及间接ELISA方法的建立

作者：张智; 刘泽; 杜宇; 乌吉斯古楞; 刘重阳; 宋庆庆; 关平原; 任旭荣^*

来源：黑龙江畜牧兽医, 2022, (02): 79-84.

DOI：10.13881/j.cnki.hljxmsy.2021.01.0045

• 牛
• 溶血性曼氏杆菌
• PlpE基因
• 原核表达
• 间接ELISA

为了建立一种能够方便、高效检测溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica)的方法,试验将溶血性曼氏杆菌重组质粒pET-32a-PlpE转化至BL21(DE3)感受态细胞,然后经IPTG诱导表达并纯化。以重组蛋白PlpE为包被抗原,通过优化抗原最佳包被浓度、一抗及二抗最佳稀释度、最佳反应时间和最佳显色时间等试验条件,建立了检测PlpE抗体的间接ELISA方法。结果表明:重组质粒pET-32a-PlpE转化至感受态细胞BL21(DE3)后利用IPTG诱导,重组蛋白主要在沉淀中大量表达,经包涵体纯化试剂盒纯化后获得纯度较高的目的蛋白。重组蛋白PlpE具有良好的反应性,且蛋白大小符合预期。确定的检测条件为抗原包被浓度2μg/mL,一抗稀释度1∶300,酶标二抗稀释度1∶80 000,反应时间45 min,一抗反应时间30 min,显色时间15 min。用该方法检出溶血性曼氏杆菌阳性血清的最低效价可达1∶1 280,检测牛病毒性腹泻病毒阳性血清、牛传染性鼻气管炎病毒阳性血清、口蹄疫病毒阳性血清、副结核分枝杆菌阳性血清、布鲁氏杆菌阳性血清,结果均为阴性;批内重复性试验和批间重复性试验变异系数分别为0.70%～4.70%和0.50%～5.60%,均小于6.00%,该方法重复性较好。说明本试验建立的检测PlpE抗体的间接ELISA方法具有较高的敏感性和特异性,可用于临床牛血清抗体的检测。

• 单位
  兽用疫苗国家工程实验室; 内蒙古农业大学; 农业部; 金宇保灵生物药品有限公司