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摘要
【目的】WRKY是转录因子大家族,在植物生长发育及逆境胁迫应答中发挥着核心调控作用。通过分析转录因子MsWRKY42在紫花苜蓿抗逆境过程中的作用,为进一步研究WRKY转录因子在紫花苜蓿抗逆分子调控中的作用奠定基础。【方法】通过同源比对方法从紫花苜蓿转录组基础数据库中获得MsWRKY42序列。使用MEGA-X对MsWRKY42蛋白序列及拟南芥序列进行多序列比对,构建系统发育树。通过PlantCARE预测分析MsWRKY42启动子的顺式作用元件。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法分析MsWRKY42在紫花苜蓿不同组织中的表达量及其在NaCl(0.3 mol·L-1)、PEG(15%)、4℃、40℃、低磷以及ABA(0.1×10-3 mol·L-1)处理后的表达量变化。构建pCAMBIA1300-WRKY-GFP融合表达载体,通过农杆菌转化本氏烟草(Nicotiana benthamiana),确定MsWRKY42蛋白的亚细胞定位。利用酵母单杂交系统检测MsWRKY42和启动子区域顺式作用元件W-box的体外结合活性。【结果】该基因包含1个1 692 bp的开放阅读框,编码563个氨基酸。多序列比对及系统进化树分析表明,该蛋白属于Ⅱb类WRKY家族成员,含有1个WRKY保守结构域和1个C2H2锌指基序,与拟南芥WRKY家族中的At WRKY42相似度最高,故将其命名为MsWRKY42。在紫花苜蓿MsWRKY42启动子区域鉴定到多个顺式作用元件,主要包括胁迫响应、激素响应、生长发育等不同生命活动相关的调控作用元件。实时荧光定量PCR结果表明,MsWRKY42在紫花苜蓿各组织中均有不同程度的表达,其中根、叶中的表达量最高,茎、花、荚果中次之,芽中最低。经NaCl、PEG、低温、高温、低磷和ABA处理后的MsWRKY42表达量均有不同程度的上调。亚细胞定位结果显示,MsWRKY42蛋白定位在细胞核上。酵母单杂交系统检测结果显示,MsWRKY42能够与W-box顺式作用元件特异性结合。【结论】MsWRKY42为典型的WRKY转录因子,蛋白质定位在细胞核,能够与W-box顺式作用元件特异性结合;该基因在紫花苜蓿不同组织部位中均有表达,在根和叶中的表达量最高,且表达受NaCl、PEG、低温、高温胁迫和ABA激素的正向诱导。在紫花苜蓿中,该基因可能参与多种非生物胁迫反应。
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