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摘要
目的 鼠伤寒沙门菌效应蛋白SteC是沙门菌Ⅲ型分泌系统中唯一的一种激酶，然而其与以往发现的激酶同源性均较低，其发挥激酶功能的机制尚不清楚。本研究通过基因克隆、原核表达截短鼠伤寒沙门菌效应蛋白SteC-C端催化结构域，获得纯化蛋白并进行晶体培养，为揭示SteC作为激酶催化磷酸化的机制奠定基础。方法 以鼠伤寒沙门菌效应蛋白SteC生物信息学分析为基础，在SteC-C端催化结构域进行片段截取，并将此结构域中仅有的第276位半胱氨酸突变为丝氨酸，利用基因克隆技术分别构建SteC C1-pGl01和SteC C1C276S-pGl01两种重组质粒，在大肠埃希菌原核体系中进行表达。依次使用镍离子亲和层析柱、凝胶层析柱进行蛋白纯化。使用12种晶体试剂盒筛选适合SteC活性(Holo)与非活性(Apo)状态晶体生长的条件，从而获得SteC不同类型的蛋白质晶体，并使用additive试剂盒寻找更利于蛋白晶体生长的条件，从而获得单晶性良好的晶体。结果 鼠伤寒沙门菌效应蛋白SteC C1催化结构域相对分子质量大小为19.7×103,在原核表达体系中蛋白可溶性好、浓度高，但是蛋白性质不稳定存在二聚化现象，其突变体证明SteC Cys-276是SteC C1导致二聚化的原因。两种蛋白均在2.0 mol/LAmmonium sulfate, 0.01 mol/L Magnesium sulfate heptahydrate, 0.05 mol/LSodium cacodylate trihydrate(pH 6.5)条件结晶，且SteC C1C276S晶体结晶时间更快，添加0.1mol/L碘化钠试剂后更有助于蛋白晶体的生长。结论 成功构建SteC C1及SteC C1C276S原核表达系统并获得蛋白进行结晶培养。硫酸铵盐有助于SteC C1结构域及其突变体晶体的形成且突变体更容易结晶。SteC C1结构域蛋白晶体的培养为SteC蛋白质空间结构的解析及进一步揭示其催化磷酸化的分子机制奠定了基础。
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