胞红蛋白的巯基修饰与光谱检测

作者：周丹蕾

来源：光谱学与光谱分析, 2019, 39(09): 2868-2872.

• 胞红蛋白
• 化学修饰
• 4-PDS法
• 光谱检测

胞红蛋白(Cygb)是珠蛋白家族中一个近期发现的血红素蛋白,含有血红素辅基,能在卟啉环的铁原子上可逆地结合氧分子,在储存和传递氧中起着重要作用,其C38和C83处含有半胱氨酸。对Cygb上半胱氨酸进行修饰可影响其结合氧的功能。用化学试剂4,4’-二吡啶二硫(4-PDS)、 N-乙基马来酰亚胺(NEM)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)和二硫苏糖醇(DTT)对纯化的胞红蛋白进行修饰,以分别生成胞红蛋白分子内二硫键(Cygb-SS)、胞红蛋白硫醚键(Cygb-SC)、分子间二硫键(Cygb-SSG)及胞红蛋白自由巯基(Cygb-SH)。修饰效果用4,4’-二吡啶基二硫(4-PDS)光谱法进行检测,该方法通过测量修饰的胞红蛋白中自由巯基的含量来计算修饰率。在Cygb-SS和Cygb-SC样品中检测到巯基浓度比样品浓度的十分之一还低,说明胞红蛋白上的自由巯基已被4-PDS和NEM所占据; Cygb-SSG样品中检测到巯基浓度与蛋白浓度相当,说明Cygb分子中有一个巯基参加了反应,由于Cygb空间位阻的存在,另一个巯基没有改变仍以自由状态存在; Cygb-SH样品中巯基浓度是蛋白浓度的两倍说明一个Cygb分子中含有两个自由巯基。通过分别检测这四种Cygb中自由巯基的含量便可知道其修饰产率。结果表明上述化学试剂均成功地修饰了胞红蛋白,修饰率达到90%以上。将4-PDS光谱法用于检测胞红蛋白化学修饰效果,通过测半胱氨酸巯基浓度验证了该方法的可行性。综上说明4-PDS光谱检测法准确可靠,是对经典Ellman试剂法的补充,更适用于吸收峰在410～420 nm的化合物巯基含量测定。

• 单位
  生命学院; 北京理工大学