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摘要
莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase, MMLV RT)是目前生物医学工具酶中最常用的逆转录酶。伴随新冠疫情的爆发，人们对于逆转录酶的应用需求不断扩大。为探索逆转录酶的制备方法和酶学表征，研究通过重叠延伸PCR合成目的基因，同源重组构建MMLV RT重组表达载体。将其转入大肠杆菌BL21(DE3)后，在18℃、 0.3 mmol/L IPTG条件下诱导表达20 h, 4℃超声处理后离心收集上清液，通过Ni-NTA亲和层析获得纯度为(93.40±0.63)%的逆转录酶rMMLV RT。通过BCA蛋白定量法测得1L重组表达菌的发酵液可以制备22.47 mg的逆转录酶rMMLV RT。酶活检测结果显示：rMMLV RT的比活力为5.116×106 U/mg。在35～50℃下孵育30 min, rMMLV RT的逆转录效率良好；在55～75℃下孵育30 min, rMMLV RT的逆转录效率大幅降低，在65℃以上接近失活。在热处理30 min的状态下，rMMLV RT的半失活温度T50为(56.20±0.27)℃。表达逆转录酶MMLV RT基因的载体成功构建以及重组蛋白纯化工艺探索，为进一步进行其功能研究，结构优化改造奠定了基础。
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