氯硝柳胺对光滑双脐螺氧化磷酸化的影响

作者：张苏阳; 邢云天; 袁轩; 曲国立; 姚甲凯; 戴建荣^*

来源：中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2022, 40(01): 61-67.

• 光滑双脐螺
• 氯硝柳胺
• 线粒体膜电位
• 氧化磷酸化

目的 研究氯硝柳胺对光滑双脐螺氧化磷酸化的影响，探讨氯硝柳胺的杀螺机制。方法 用线粒体提取试剂盒提取光滑双脐螺成螺线粒体，考马斯蓝染色法检测提取线粒体蛋白含量，用线粒体复合体Ⅳ活性检测试剂盒检测提取过程中组织破碎液、丢弃上清和线粒体悬液中复合体Ⅳ活性以评价提取线粒体的纯度。用线粒体复合物活性检测试剂盒提取光滑双脐螺的线粒体复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，每种复合物各分成0.2μg/ml、1.0μg/ml组和二甲基亚砜(DMSO)组，分别加入终浓度为0.2和1.0μg/ml的氯硝柳胺、0.5%DMSO，分别测定不同波长处的吸光度(A值)，计算复合体的活力值。在96孔板中每孔加入蛋白浓度为33μg/ml的线粒体悬液，分别加入终浓度为0.2和1.0μg/ml的氯硝柳胺(0.2μg/ml组和1.0μg/ml组)或0.5%DMSO (DMSO组)，测定25℃条件下10、20、30 min的A520值，计算线粒体膜通透性转运孔(m PTP)开放度。在96孔板中每孔加入含终浓度为5μg/ml的JC-1染料、蛋白浓度为0.1 mg/ml的线粒体悬液，0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μg/ml组分别加入终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8和1.0μg/ml的氯硝柳胺，氰化羰基-3-氯苯腙(CCCP)组加入20μg/ml的CCCP作阳性对照组，DMSO组加入0.5%的DMSO作阴性对照组，在激发光485 nm、发射光590 nm、25℃条件下连续检测荧光强度30 min。组间比较采用单因素方差分析。结果 提取获得的线粒体总蛋白浓度为(4.24±0.11) mg/ml,组织破碎液、丢弃上清和线粒体悬液中电子传递链复合物Ⅳ活性分别为(14.88±1.80)、(5.60±0.96)、(24.19±3.53) U/mg,3组间差异有统计学意义(F=46.922,P<0.01)。0.2μg/ml组、1.0μg/ml组与DMSO组的复合物Ⅰ活性分别为(523.98±120.37)、(559.74±238.48)、(796.64±218.79) U/mg；复合物Ⅱ各组活性分别为(3.70±0.36)、(3.54±1.90)、(5.47±2.18) U/mg；复合物Ⅲ各组活性分别为(6.03±0.79)、(5.01±0.80)、(5.82±0.69) U/mg；复合物Ⅳ各组活性分别为(31.20±3.99)、(32.08±3.20)、(30.82±4.21) U/mg；复合体Ⅴ各组活性分别为(22.38±3.83)、(23.08±6.50)、(25.84±6.86) U/mg。0.2μg/ml组、1.0μg/ml组线粒体复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ活性与DMSO组差异均无统计学意义(F=1.658、1.215、1.181、0.138、0.298,P>0.05)。加入氯硝柳胺10 min时，0.2μg/ml组、1.0μg/ml组和DMSO组mPTP开放度分别为(0.040±0.005)、(0.041±0.002)、(0.039±0.036)；加入20 min时分别为(0.069±0.008)、(0.067±0.002)、(0.065±0.015)；加入30 min时分别为(0.090±0.009)、(0.088±0.002)、(0.087±0.012)。加入氯硝柳胺10、20、30 min,0.2μg/ml组、1.0μg/ml组与DMSO组mPTP开放度差异均无统计学意义(F=0.025、0.094、0.060,P>0.05)。相对于DMSO组(1.000)，在加入氯硝柳胺15 min时0.6、0.8和1.0μg/ml组的线粒体膜电位分别为(0.874±0.008)、(0.843±0.018)、(0.773±0.027)，均低于DMSO组(F=44.285,P<0.05)；加入30 min时，0.2、0.4、0.6、0.8和1.0μg/ml组的线粒体膜电位分别为(0.951±0.051)、(0.886±0.022)、(0.766±0.019)、(0.746±0.016)、(0.675±0.021)，除0.2μg/ml组，其余各组均低于DMSO组(F=125.738,P<0.01)。结论 浓度低于1.0μg/ml的氯硝柳胺对光滑双脐螺线粒体电子传递链复合物活性无影响，也未造成线粒体膜通透性转运孔的开放，但可引起光滑双脐螺线粒体膜电位的剧烈下降，影响光滑双脐螺的氧化磷酸化过程。

• 单位
  江苏省血吸虫病防治研究所