周期蛋白D1正反义表达质粒的构建鉴定及其对哮喘大鼠气道平滑肌增殖的影响

作者：乔礼芬; 徐永健; 刘先胜; 谢俊刚; 杜春玲; 张建; 倪望; 陈士新

来源：药学学报, 2008, (03): 247-252.

DOI：10.16438/j.0513-4870.2008.03.008

• CyclinD1
• 表达载体
• 哮喘
• 气道平滑肌细胞
• 增殖

观察哮喘大鼠气道平滑肌周期蛋白D1的表达,并构建大鼠周期蛋白D1(CyclinD1)正反义表达质粒,转染支气管哮喘大鼠气道平滑肌细胞(ASMC),探讨CyclinD1在哮喘大鼠ASMC增殖过程中的影响。大鼠雾化吸入卵清蛋白建立哮喘模型,免疫荧光检测CyclinD1的表达。以气道平滑肌条总RNA为模板,通过RT-PCR获取大鼠CyclinD1全长cDNA,插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,构建CyclinD1正义表达质粒(pcDNA3.1-CyclinD1)和反义表达质粒(pcDNA3.1-asCyclinD1)。用脂质体介导的基因转染方法,将正反义重组体和空质粒(vector)分别转染哮喘大鼠和正常大鼠ASMC,用Western blotting方法鉴定CyclinD1基因的表达。采用流式细胞术、四甲基偶氮唑盐(MTT)法、增殖细胞核抗原(PCNA)染色等方法观察构建质粒对哮喘大鼠ASMC增殖的影响。结果表明:(1)与对照组相比,哮喘组CyclinD1表达显著增高;(2)酶切鉴定和测序分析证实,试验成功构建了CyclinD1正反义表达质粒。与转染pcDNA3.1-CyclinD1组和vector组相比,转染pcDNA3.1-asCyclinD1组大鼠ASMC中CyclinD1表达水平下降(P<0.01);(3)与vector组S+G2M期比例、吸收度(A)值、PCNA阳性表达率相比,转染pcDNA3.1-CyclinD1组增殖指标均明显增加(P<0.01)。转染pcDNA3.1-asCyclinD1组增殖指标均明显下降(P<0.01)。正常组大鼠转染质粒后各组间变化趋势与哮喘组一致。pcDNA3.1-CyclinD1可促进哮喘大鼠ASMC增殖,pcDNA3.1-asCyclinD1可抑制哮喘大鼠ASMC增殖,提示CyclinD1在哮喘ASMC增殖的信号转导中具有重要作用。

• 单位
  华中科技大学同济医学院附属同济医院