负载桑黄素的碳点紫外光交联壳聚糖水凝胶对大鼠软骨损伤的作用及其机制研究

作者：曲彦隆^*; 关正瑞; 南飞; 刘思遥; 刘禄萌

来源：中国修复重建外科杂志, 2022, 36(12): 1524-1533.

• 膝关节
• 骨关节炎
• 桑黄素
• 碳点
• 壳聚糖水凝胶
• 大鼠

目的 构建负载桑黄素的碳点紫外光交联壳聚糖（ultraviolet-cross-linkable chitosan-carbon dotsmorin,NMCM）水凝胶，通过体内外实验观察其能否修复软骨损伤，并探讨相关机制。方法 取壳聚糖联合甲基丙烯酰酐制备紫外光（ultraviolet,UV）交联壳聚糖、联合丙烯酰胺制备碳点，两者混合后加入桑黄素溶液，在UV下照射交联，获得NMCM水凝胶，检测其缓释性能。取关节置换患者自愿捐赠的正常及膝关节骨关节炎（knee osteoarthritis,KOA）软骨组织，分离培养软骨细胞并经甲苯胺蓝染色鉴定。取第3代KOA软骨细胞，首先分别与12.5、25.0、50.0μmol/L桑黄素及负载该浓度桑黄素的NMCM水凝胶混合培养，细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)法检测上述浓度桑黄素及水凝胶对软骨细胞增殖的影响；然后与负载50μmol/L桑黄素的NMCM水凝胶共培养，免疫荧光染色检测Ⅱ型胶原蛋白（collagen typeⅡ，COL-Ⅱ）水平、2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯探针检测活性氧水平。取4周龄SD大鼠20只，构建右后肢膝关节软骨损伤模型，随机分为两组（n=10）；其中实验组软骨缺损处注射负载25μmol/L桑黄素的NMCM水凝胶，对照组不作处理。术后4周，取标本micro-CT观察股骨髁软骨缺损修复情况，大体观察缺损部位并行国际软骨修复协会（ICRS）大体评分，番红-O固绿染色及COL-Ⅱ免疫组织化学染色观察软骨和软骨下骨并行ICRS组织学评分，Western blot以及实时荧光定量PCR检测软骨组织中TNF-α、NF-κB、基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13,MMP-13)、COL-Ⅱ蛋白及mRNA表达。结果 实验成功构建负载不同浓度桑黄素的NMCM水凝胶，其短时间内药物释放速度较快，24 h后速度逐渐放缓，96 h时释放量接近于0，此时药物累积释放率达88%。浓度≤50μmol/L的桑黄素对软骨细胞无毒性作用，且在NMCM水凝胶干预下，软骨细胞增殖能力提高（P<0.05）。NMCM水凝胶可提高KOA软骨细胞中COL-Ⅱ水平（P<0.05），降低活性氧水平（P<0.05），但尚未达正常水平（P<0.05）。动物实验显示，实验组术后4周关节面粗糙，软骨缺损可见，但其周围有组织修复，关节间隙仍保持正常；对照组关节面更粗糙，软骨缺损未见组织修复。与对照组相比，实验组软骨细胞较多，COL-Ⅱ表达增强，ICRS大体及组织学评分均较高（P<0.05）;MMP-13、NF-κB、TNF-α蛋白及mRNA相对表达量降低，COL-Ⅱ蛋白及COL-2a1 mRNA升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 NMCM水凝胶能促进大鼠膝关节软骨细胞增殖、抑制软骨细胞分解代谢，抵抗氧化应激反应，保护软骨细胞，促进软骨修复。

• 单位
  哈尔滨医科大学附属第一医院