人源性受磷蛋白稳定表达细胞系的构建

作者：陈岚卿; 王宇宁; 李典一; 徐路遥; 李廉杰; 李泽浩; 刘华; 刘茜^*

来源：法医学杂志, 2021, 37(05): 615-620.

DOI：10.12116/j.issn.1004-5619.2020.400909

• 法医病理学
• 法医毒理学
• 受磷蛋白
• 人源性细胞系
• 乌头碱
• 生物化学
• 分子生物学

目的构建稳定表达人源性受磷蛋白(phospholamban,PLN)的细胞系,并初步探索其在心肌毒性机制研究中的应用。方法采用Fast Cloning方法将目的基因PLN的开放阅读框序列插入至真核表达载体pc DNA5/FRT/TO(以下简称p DFT),构建p DFT-PLN-Flag质粒,并与p OG44质粒共转染Flp-InTMT-RExTM293细胞,实现目的基因的表达,通过潮霉素B抗性持续压力筛选出重组成功的单克隆细胞株。应用West-ern印迹法和间接免疫荧光法检验重组细胞目的蛋白的表达情况。对构建成功的细胞系进行乌头碱染毒后,通过Western印迹法,检测PLN磷酸化的变化。结果重组质粒PCR扩增及DNA电泳后含有与已知PLN基因片段大小一致的扩增产物,测序后与人源性PLN基因开放阅读框(open reading frame,ORF)序列一致。间接免疫荧光法和Western印迹法提示构建的可增殖细胞系,诱导调控下可稳定且较高水平表达人源性PLN。乌头碱浓度为1μmol/L、染毒2 h时,PLN的Thr17位点磷酸化水平降低。结论该人源性细胞株可以稳定表达PLN,并可用于乌头碱在分子水平上对细胞影响机制的研究。

• 单位
  华中科技大学同济医学院