外周血干细胞采集物来源的巨细胞病毒特异性T细胞的体外培养和扩增

作者：夏瑜; 张在利; 李莎; 詹茜; 肖青; 王利; 刘林; 罗小华^*

来源：细胞与分子免疫学杂志, 2019, 35(01): 63-73.

DOI：10.13423/j.cnki.cjcmi.008745

• 巨细胞病毒特异性T细胞
• 细胞因子
• 外周血干细胞采集物
• 体外扩增

目的建立巨细胞病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞(CMV CTL)体外扩增的方法。方法用1μg/mL全长巨细胞病毒pp65(CMV pp65)多肽体外多轮刺激由粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)动员的外周血干细胞采集物中分离的单个核细胞(PBMC),同时加入白细胞介素2(IL-2)、 IL-15、 IL-21扩增20 d。在培养第7天,加入丝裂霉素处理的负载CMV pp65抗原肽的自体PBMC,第10天补充经γ射线辐照处理并负载CMV pp65抗原肽的PBMC和CD3(OKT3);对照组为未加入抗原肽进行扩增的PBMC组。采用多色流式细胞术分别对扩增前、扩增后的T淋巴细胞表型及细胞内肿瘤坏死因子α(TNF-α)和γ干扰素(IFN-γ)的分泌水平进行分析, ELISA检测供者血清中CMV IgM/IgG抗体滴度水平。结果培养后可以收集得到(165.26±6.14)×106个细胞,其中CD3+ T细胞占89.21%, CD8+ T细胞占CD3+ T细胞的(43.54±28.03)%, CD4+ T细胞占CD3+ T细胞(34.23±26.18)%。获得的CD3+ T细胞以效应记忆性T细胞(TEM)为主,且扩增培养后的CD8+和CD4+ TEM比例较培养前显著增高。另外,培养后干细胞样记忆性T细胞(TSCM)和组织原位记忆T细胞(TRM)的比例均较培养前显著增加。在功能实验中,培养后得到的IFN-γ+的分泌型CMV特异性CD8+ T细胞群比例较扩增前明显增加, TNF-α+ CMV特异性CD8+ T细胞比例呈增长趋势;能够分别分泌IFN-γ和TNF-α的CMV特异性CD4+ T细胞群比例与培养前无明显变化。此外,供者体内CMV IgG水平与供者年龄呈现正相关,且在该培养体系下, IFN-γ+和TNF-α+ CMV特异性T细胞扩增比例与供者年龄呈负相关。结论本研究成功建立了在体外有效的培养和扩增CMV CTL的方法。

• 单位
  重庆医科大学附属第一医院