慢病毒介导的TACO-shRNA通过促进吞噬体与溶酶体融合提高巨噬细胞清除结核分枝杆菌的能力

作者：陈洁; 呙阳; 邓亚婷; 江红; 黄自坤; 罗清; 叶建青; 李俊明

来源：中华微生物学和免疫学杂志, 2015, 35(10): 735-740.

• 富含色氨酸天冬氨酸膜蛋白
• RNA干扰
• 慢病毒
• 巨噬细胞
• 结核分枝杆菌

目的构建以富含色氨酸天冬氨酸膜蛋白(TTACO)基因为靶点的短发夹状RNA(shRNA)表达慢病毒载体,鉴定其下调TACO表达的效果,以及对巨噬细胞吞噬和杀伤胞内结核分枝杆菌(M.tb)的影响及相关机制。方法设计3条靶向小鼠TACO基因的shRNA表达片段及1条随机序列对照片段,插入慢病毒表达载体pSicoR后利用293T细胞进行病毒包装。采用包装成功的慢病毒颗粒感染RAW264.7细胞,分别采用real-time RT-PCR和Western blot方法鉴定干扰效果。选择沉默效果最佳的重组慢病毒感染RAW264.7细胞,48 h后再采用M.tb对这些巨噬细胞进行感染,倍比稀释培养法进行细胞内荷菌量的检测,免疫荧光结合激光共聚焦显微镜检测巨噬细胞内M.tb与溶酶体的共定位情况,cytoID细胞自噬检测试剂盒检测各组细胞的自噬水平,Western blot法检测自噬相关蛋白LC3的表达水平。结果测序结果证实重组慢病毒表达载体均构建成功。靶向TACO基因的3种重组慢病毒均可下调RAW264.7细胞中TACO的表达,其中LV-pSRT1的效果最佳。LV-pSRT1感染组RAW264.7细胞内的荷菌量在感染后0 h时即显著低于对照慢病毒(LV-pSRTc)感染组(5.50×104vs 8.1×104,P<0.05)。以M.tb感染后0 h时间点的细胞内荷菌量为基准,M.tb感染后48 h和72 h时LV-pSRT1感染组RAW264.7细胞内M.tb的存活率显著低于对照慢病毒感染组(48 h:134.54%vs 213.58%,P<0.05;72 h:148.18%vs 262.96%,P<0.05)。与对照慢病毒感染组比较,LV-pSRT1感染组RAW264.7细胞内M.tb与溶酶体的共定位率显著上调(75.67%vs 10.66%,P<0.05),同时细胞的自噬水平显著上调(16.20%vs 8.50%,P<0.05),LC3Ⅱ的相对表达水平也显著提高(0.51 vs 0.34,P<0.05)。结论 TACO基因特异性RNAi慢病毒表达载体可有效抑制RAW264.7细胞中TACO的表达,抑制巨噬细胞对M.tb的吞噬能力,增强巨噬细胞对胞内M.tb的清除能力。下调TACO表达对巨噬细胞杀伤胞内M.tb影响的机制与其通过自噬溶酶体途径提高M.tb吞噬体与溶酶体的融合有关。

• 单位
  南昌大学第一附属医院