斑马鱼myd88和traf6真核表达载体的构建

作者：徐行; 王子睿; 刘何奕; 张颖; 任建峰; 李伟明; 张庆华^*

来源：基因组学与应用生物学, 2021, 40(04): 1488-1496.

DOI：10.13417/j.gab.040.001488

• 斑马鱼
• pCMV-myd88
• pCMV-traf6
• 真核表达载体

髓样分化因子88 (myeloid differentiation primary response gene 88, MYD88)和TNF受体相关因子6(TNF receptor associated factor 6, TRAF6)均属于Toll样受体(Toll-like receptors, TLR)家族成员中的关键衔接分子。斑马鱼是研究先天免疫应答的独特模式生物,为了构建myD88和traf6的真核表达载体,用于免疫应答机制的研究,克隆了斑马鱼myd88和traf6基因的编码区CDS全长序列,分别是855 bp和1 629 bp。结构分析表明,斑马鱼MYD88存在2个保守结构域为死亡结构域和TIR结构域,TRAF6存在4个保守结构域分别为RING结构域、2个锌指结构域、环-环(coiled-coil)结构域以及TRAF同源结构域(meprinand TRAF-homology, MATH),并与其他物种氨基酸序列一致性较高。系统进化树分析发现斑马鱼myd88和traf6基因与硬骨鱼类亲缘关系较近,说明斑马鱼myd88和traf6基因的同源性符合其在物种进化上的地位并且具有很高的结构同源性。将斑马鱼myd88和traf6基因的CDS全长序列连接至pCMV-Tag2B表达载体。通过对重组质粒进行双酶切检测发现,成功克隆了斑马鱼pCMV-myd88和pCMV-traf6真核表达载体。为了验证这2个真核表达载体的生物学功能,本研究在HEK293T细胞中进行NF-κB的报告基因活性检测。结果表明,过表达myd88和traf6基因后,斑马鱼NF-κB家族nfκb1启动子的转录活性显著升高,分别约为空载对照组的2.5倍和8倍。鉴于MYD88和TRAF6在天然免疫功能等方面的重要作用,实验结果为以后研究斑马鱼的先天免疫信号传导过程提供了有力的研究工具。

• 单位
  国家水生动物病原库; 上海海洋大学