不结球白菜Pol胞质雄性不育花酵母双杂交cDNA文库的构建及筛选

作者：钱瑜; 刘同坤; 侯喜林; 李英^*

来源：南京农业大学学报, 2015, 38(01): 21-26.

• 不结球白菜
• Pol胞质雄性不育(Pol CMS)
• 酵母双杂交

[目的]构建不结球白菜Pol胞质雄性不育花酵母双杂交cDNA文库,筛选与细胞色素C还原酶铁硫蛋白(BcRISP1)互作的蛋白。[方法]从不结球白菜Pol胞质雄性不育花中提取总RNA,通过长距离PCR,扩增双链cDNA(ds cDNA)。采用SMART建库技术构建不结球白菜Pol胞质雄性不育花全长cDNA文库。利用BcRISP1基因的开放阅读框,构建诱饵表达载体pGBK T-7-BcRISP1转化AH109酵母菌,根据酵母双杂交技术筛选出与BcRISP1互作的片段,并进行质粒共转化验证。[结果]经检测,文库的转化率为每μg p GADT7-Rec 1.80×106转化子,文库滴度为1.21×107CFU·m L-1,重组率为94%,成功构建可以用于酵母双杂交的cDNA文库。酵母双杂交技术获得了与BcRISP1互作的阳性克隆,试验表明诱饵载体表达产物对酵母无毒性作用,质粒共转化试验初步验证了BcRISP1与CYP81G、PIP2蛋白的互作关系。[结论]cDNA文库的成功构建为后期互作蛋白的顺利筛选奠定了基础,利用酵母双杂交技术成功获得与BcRISP1互作的蛋白CYP81G和PIP2,为明确不结球白菜Pol胞质雄性不育相关基因的信号传递通路提供更多的依据,以期从分子水平上进一步阐明不结球白菜Pol胞质雄性不育的机制。

• 单位
  南京农业大学