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摘要
聚对苯二甲酸乙二醇酯[poly(ethylene terephthalate), PET]降解酶的发掘是国内外研究的热点。双(2-羟乙基)对苯二甲酸酯[bis-(2-hydroxyethyl) terephthalic acid, BHET]是PET降解过程的一种中间化合物，会与PET竞争酶的底物结合位点，从而抑制PET进一步降解。因此，探寻新型BHET降解酶，对进一步提高PET的降解效率具有促进作用。本研究通过基因挖掘发现了一种来源于浅黄糖丝菌(Saccharothrixluteola)参与PET降解过程的水解酶基因sle(ID:CP064192.1,5085270–5086049)，其编码的蛋白质可以将BHET水解为单(2-羟乙基)对苯二甲酸酯[mono-(2-hydroxyethyl) terephthalate, MHET]和对苯二甲酸(terephthalic acid, TPA)。将BHET水解酶(Sle)通过重组质粒在大肠杆菌(Escherichia coli)中异源表达，结果表明，在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside, IPTG)诱导终浓度为0.4 mmol/L，诱导时长为12 h，诱导温度为20℃时蛋白的表达量最高。通过镍亲和层析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析3步分离纯化，获得了高纯度的Sle重组蛋白；同时对其酶学性质进行了表征，Sle最适温度和pH分别为35℃和8.0，在25–35℃和pH 7.0–9.0区间内能保持80%以上的残余酶活，且金属离子Co2+能提高酶活力；进一步通过同源序列及Sle复合物结构分析得知，该酶属于二烯酸内酯水解酶(dienelactone hydrolase, DLH)家族，具备该家族典型的催化三联体，预测其催化位点分别为S129、D175和H207，并初步分析了其催化机理。最后，利用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)鉴定了该酶能够特异性降解BHET生成MHET和TPA，属于BHET降解酶。本研究为生物酶法高效降解PET塑料提供了新的酶资源。
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