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摘要
H3N2犬流感病毒（H3N2 CIV）是流感病毒在进化过程中新形成的一个分支，在我国多地的犬中广泛流行。PB1-F2蛋白是甲型流感病毒的毒力因子，并可能与流感病毒的跨宿主传播相关。为探究PB1-F2长度的改变对H3N2 CIV的影响，本研究分别构建了包含H3N2 CIV各基因节段的重组质粒及携带M1R(PB1-F2的aa1由M突变为R)及S11Stop(PB1-F2 aa11由S突变为终止氨基酸序列)突变的重组质粒pHW-PB1-F2-M1R和pHW-PB1-F2-S11Stop，并均经测序鉴定。通过反向遗传操作技术，分别拯救了如下3株重组病毒：表达90个氨基酸PB1-F2的重组亲本病毒rH3N2；不表达PB1-F2的重组病毒rH3N2-M1R；仅表达11个氨基酸PB1-F2的重组病毒rH3N2-S11Stop。将这3株重组病毒利用MDCK细胞传代后分别对其8个基因节段经PCR扩增及测序以鉴定其遗传稳定性。测序鉴定结果显示，3株重组病毒均正确构建，且不同代次之间各重组病毒的基因序列及各突变位点均相同，表明本研究构建的重组病毒具有较好的遗传稳定性。将表达PB1、PB1-F2-M1R及PB1-F2-S11Stop的重组质粒分别与重组质粒PB2、PA和荧光素酶报告质粒pPolI-Luci-NP及海肾荧光素酶表达质粒共转染293T细胞，48 h后利用双荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶活性并比较3株重组病毒的聚合酶活性；测定3株重组病毒感染MDCK细胞后不同时间的TCID50以绘制病毒的生长曲线；将3株重组病毒均以106TCID50/50μL经鼻腔感染小鼠，分析各重组病毒对小鼠的致病性。用以评价PB1-F2长度改变对H3N2 CIV的影响。结果显示，rH3N2-S11Stop的聚合酶活性与rH3N2相比无明显变化，而rH3N2-M1R的聚合酶活性则显著高于rH3N2(P<0.05);rH3N2-M1R和rH3N2-S11Stop在MDCK细胞中的复制效率显著高于rH3N2(P<0.05)，且rH3N2-M1R的复制效率要高于rH3N2-S11Stop。小鼠的致病性试验结果显示，感染重组病毒后的小鼠表现被毛粗乱、精神不振、食欲减退等症状；3株重组病毒均对小鼠体质量有轻微影响，并对小鼠肺脏均造成了轻微病理损伤，但三者对小鼠体质量及肺脏的影响差别不明显。本实验结果首次证实，PB1-F2的不表达能够提高H3N2 CIV的转录效果，且PB1-F2长度的改变能够提高H3N2 CIV在细胞中的复制效率，但对病毒在小鼠中致病性的影响较小。本研究初步探究了PB1-F2长度的改变对H3N2 CIV的影响，为该病毒致病机制及其感染防控技术的研究与制定提供了参考依据。
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