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摘要
目的制备抗B组柯萨奇病毒(Coxsackievirus, CVB)3C蛋白的多克隆抗体。方法通过聚合酶链式反应从pcDNA3.1(+)-EGFP-3C中扩增编码3C的DNA片段, 构建pET28a(+)-3C-6His表达载体, 转化至大肠埃希菌(Escherichia coli, E.Coli)BL21(DE3)以表达3C重组蛋白。优化表达条件及菌体蛋白的提取方法, 经超声破碎制备菌体总蛋白, 经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)后, 用氯化钾进行胶染色, 切胶回收相对分子质量为26 000的蛋白, 即纯化的3C重组蛋白(3C-6His的相对分子质量为26 000)。用纯化的1 mg 3C重组蛋白加等量弗氏佐剂免疫新西兰大白兔, 共免疫5次, 每次间隔1周, 免疫结束后1周取兔血清, 检测抗体的特异性。结果在相对分子质量为26 000的位置检测到了3C-6His融合蛋白的表达, 成功构建了高效表达带His标签的3C重组蛋白载体。重组3C蛋白原核优化表达条件为37 ℃培养细菌6 h, 加0.05 mmol/L异丙基β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside, IPTG)进行诱导。经SDS-PAGE分离菌体总蛋白, 得到了纯化的3C重组蛋白。获得的兔免疫血清可以结合E.Coli及HeLa细胞表达的3C蛋白, 还能识别感染CVB3或肠道病毒A71的HeLa细胞中表达的3C蛋白。结论获得了抗CVB3 3C蛋白酶的多克隆抗体, 这一抗体可特异结合肠道病毒的3C蛋白酶, 为进一步研究3C蛋白酶在肠道病毒致病机制中的作用奠定了基础。
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