鼠源pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85真核表达质粒的构建及其部分功能研究

作者：姚燕; 王淑贤; 吴银翠; 胡爽; 胡颖; 潘林鑫^*; 徐涛^*

来源：安徽医科大学学报, 2023, 58(05): 794-799.

DOI：10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2023.05.015

• NUP85
• RAW264.7细胞
• 增殖
• 凋亡
• 肿瘤坏死因子-α
• 白细胞介素-6

目的 构建鼠源pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85真核表达质粒，并观察其对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞中炎症相关因子分泌的影响及对RAW264.7细胞增殖和凋亡的影响。方法 通过PCR扩增NUP85基因，构建pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85真核表达质粒。将pcDNA3.1-3×Flag-c载体进行酶切。纯化的PCR产物与载体连接，将连接产物转化细菌感受态细胞。酶切鉴定后，再进行测序和比对分析。然后将其转染至RAW264.7细胞中，通过CCK-8实验和流式细胞术检测其对LPS诱导的RAW264.7细胞增殖和凋亡的影响，并通过Western blot技术和ELISA法检测RAW264.7细胞中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的表达情况。结果 酶切鉴定和Western blot结果显示pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85真核表达质粒成功构建和表达。CCK-8实验结果显示：24 h后过表达NUP85组细胞的存活率显著低于对照组[(0.55±0.03)vs(0.67±0.05),F=30.98,P<0.05]。流式细胞术结果显示：过表达NUP85组细胞的凋亡率高于对照组[(15.78±1.05)%vs(13.40±0.47)%,F=75.38,P<0.05]。Western blot和ELISA结果显示：转染pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85质粒后，RAW264.7细胞中的TNF-α、IL-6表达较对照组升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 NUP85能够抑制LPS刺激的RAW264.7细胞的增殖并促进其凋亡，并且NUP85促进LPS刺激的RAW264.7细胞中炎症因子IL-6和TNF-α的表达。

• 单位
  生命科学学院; 安徽医科大学