带FLAG标签的CDK4真核表达载体构建及对喉癌细胞的影响

作者：吴亚更; 马晓燕; ***; 刘佳; 王雪峰^*

来源：军事医学, 2018, 42(07): 512-516.

• 喉肿瘤
• Hep-2
• 细胞周期蛋白依赖激酶4
• 聚合酶链反应
• 克隆形成
• 细胞增殖

目的构建带Flag标签的pc DNA3. 0载体细胞周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase,CDK4)的真核表达载体,验证该基因对喉癌Hep-2细胞增殖的影响。方法以人乳腺文库为模板采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增出CDK4的CDS区编码序列,应用双酶切将带Flag标签pc DNA3. 0载体插入到PCR产物上,转化DH5α提取质粒,测序正确后转染喉癌Hep-2细胞,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测CDK4基因的转录水平,蛋白质印迹鉴定目的基因蛋白表达,CCK-8法和克隆形成实验测定其对喉癌Hep-2细胞生长的影响。结果 pc DNA3. 0-Flag-CDK4真核表达载体构建成功;提取质粒转染Hep-2细胞,qRT-PCR技术检测到该基因在Hep-2中转录水平明显增高;蛋白质印迹实验验证该基因蛋白成功表达; CCK-8法和克隆形成实验证明CDK4基因可促进Hep-2细胞增殖。结论 pc DNA3. 0-Flag-CDK4真核表达载体构建成功并验证该基因促进喉癌细胞增殖,为进一步研究该基因在喉癌中的发生发展奠定了前期基础。

• 单位
  长春中医药大学附属医院; 锦州医科大学