pGPU6/GFP质粒介导的表达钙网织蛋白基因的短发夹RNA的构建和鉴定

作者：李晓曦; 孟凡东; 孙大鹏; 仇凤启; 刘新莉; 赵丹; 马萍

来源：中国老年学杂志, 2014, 34(13): 3675-3677.

• CRT基因
• RNA干扰
• 乳腺癌

目的构建靶向钙网织蛋白(CRT)基因的短发夹RNA(shRNA)表达质粒并鉴定。方法设计并合成4对针对CRT基因的shRNA链,退火形成双链,与酶切的质粒pGPU6/GFP连接,构建4个重质粒,转化DH5а菌株,提取质粒,进行酶切鉴定和测序分析。脂质体法转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞,通过荧光倒置显微镜判定转染效率,并通过Western印迹法检测细胞中CRT基因及蛋白的表达水平。结果经酶切鉴定筛出的重组质粒测序结果与目的序列相同,重组质粒pGPU6/GFP/Neo-CRT构建成功;转染MDA-MB-231细胞后,CRT基因在mRNA及蛋白水平的表达均降低,其中pGPU6/GFP/CRT1的抑制效果最好。结论成功构建了靶向CRT基因的shRNA表达质粒,并筛选出1种对CRT基因有显著抑制作用的shRNA。

• 单位
  中国医科大学附属第一医院