转录因子E2相关因子2对EIAV复制影响的初步研究

作者：马官芹; 王岩; 林跃智; 王晓钧

来源：中国预防兽医学报, 2021, 1-8.

• Nrf2
• CRISPR/Cas9
• 敲除细胞系
• 马传染性贫血病毒

转录因子E2相关因子2（Nrf2）是重要的调节抗氧化应激的转录因子，其活性状态与病毒相关炎症及免疫清除息息相关。为研究Nrf2对马传染性贫血病毒复制的影响，本研究通过CRISPR在线设计工具，靶向于Nrf2设计2条特异性sgRNAs，将其连接到lentiCRISPRv2-GFP载体后，转染HEK293T细胞，通过流式细胞仪筛选GFP阳性表达的单细胞克隆，大量扩增后，经Western blot检测到2株未表达Nrf2的细胞，进一步通过测序发现2株细胞基因组缺失一个碱基T，导致Nrf2基因发生移码突变无法表达。表明获得Nrf2敲除的HEK293T细胞，将其命名为HEK293T-Nrf2KO。收取该细胞传代至第10代（G10）、15代（G15）、20代（G20）子细胞进行Western blot鉴定，结果显示各代子细胞均未检测到Nrf2的表达，表明该敲除细胞系可稳定遗传。将马传染性贫血病毒（EIAV）感染性克隆CMV3-8转染至HEK293T和HEK293T-Nrf2KO，同时设置Nrf2基因回补组(CMV3-8+VR1012-flag-Nrf2)，通过Western blot和反转录酶活性检测病毒的复制情况，结果显示Nrf2敲除后，病毒复制能力升高；另将EIAV假病毒感染HEK293T和HEK293T-Nrf2KO，检测病毒的荧光信号，结果显示敲除Nrf2有助于病毒感染细胞。以上结果表明，敲除Nrf2促进了EIAV的复制。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建成功的Nrf2敲除的HEK293T细胞系，为Nrf2调控病毒复制机制研究提供有效的工具，并进一步首次证实了宿主Nrf2可以抑制EIAV的复制。

• 单位
  兽医生物技术国家重点实验室; 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所