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摘要
目的:构建含人骨形态发生蛋白2(hBMP2)基因的重组腺相关病毒载体。方法:根据hBMP-2基因序列设计引物,上游引入SalI酶切位点,下游引入EcoRI酶切位点,以胚胎骨髓组织总RNA为模版进行rt-PCR反应扩增hBMP-2基因。将hBMP-2片段定向亚克隆进pAAV-IRES-GFP的MCS中,获得重组表达质粒(pAAV-hBMP2-IRES-GFP),采用磷酸钙沉淀法将该质粒与包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper共同转染到AAV293细胞,进行rAAV-hBMP2-IRES-GFP重组病毒包装。收获的病毒液按氯仿处理、PEG/NaCl沉淀、氯仿反复抽提法浓缩纯化,采用荧光计数法测定重组病毒感染滴度。结果:酶切鉴定、测序结果表明,hBMP2成功克隆入pAAV-IRES-GFP载体中。在AAV293细胞中包装出重组腺相关病毒载体的感染滴度为3.6×1011/ml。结论:成功制备了rAAV-hBMP2载体,可满足骨组织工程的需要。
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