分子对接、CRISPR/Cas9技术筛选并验证DNA ligase Ⅳ抑制剂

作者：肖红卫

来源：湖北农业科学, 2021, 60(23): 177-180.

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2021.23.039

• DNA连接酶Ⅳ
• 抑制剂
• 荧火虫荧光素酶报告载体
• CRISPR/Cas9
• 小分子化合物

为了筛选靶向DNA连接酶Ⅳ的抑制剂以实现更有效的基因定点插入,采用分子对接技术筛选出与前期研究中靶向DNA连接酶Ⅳ的抑制剂SCR7作用类似的小分子化合物。筛选到与化合物库一致的nocodazole、Fisetin和Methylene blue 3个小分子化合物,通过用MSTN基因T11位点序列截断的Firefly Luciferase荧光素酶报告载体结合CRISPR/Cas9-gRNA-T11载体共转细胞,并结合不同的小分子化合物处理。结果表明,没有用小分子化合物处理时,萤火虫荧光素酶被截断的位置发生NHEJ修复,不能得到大量有活性的萤火虫荧光素酶;经过小分子化合物处理,抑制了细胞内的NHEJ,提高了HDR效率,能得到大量有活性的萤火虫荧光素酶。使用nocodazole、Methylene blue和Fisetin处理后的萤火虫荧光素酶检测结果 65 256.3、53 713和77 058.3分别是SCR7处理后的萤火虫荧光素酶检测结果 41 905.3的1.6、1.3和1.8倍,是没有SCR7处理后的萤火虫荧光素酶检测结果 10 120的6.4、5.3和7.6倍。证明所用的筛选策略正确,所筛选出的小分子化合物是具有DNA ligase Ⅳ抑制活性的抑制剂,为后续研究奠定了基础。

• 单位
  湖北省农业科学院畜牧兽医研究所