基于CRISPR/Cas9基因编辑系统构建敲除DDX5基因的猪肾细胞系

作者：金彩燕; 吴金恩; 何童童; 孙世琪; 郭慧琛; 张小丽^*

来源：中国兽医科学, 2021, 51(10): 1259-1263.

DOI：10.16656/j.issn.1673-4696.2021.0172

• DDX5
• 敲除
• CRISPR/Cas9

利用CRISPR/Cas9基因编辑系统,建立DDX5基因敲除的PK-15细胞系。使用E-CRISPR在线设计网站分别对猪DDX5第1外显子和第2外显子设计sgRNA,以质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro (pX459)为载体,将退火后的sgRNA连接到线性化载体pX459上,得到敲除载体pX459-sgRNA-DDX5。以脂质体Lipofectamine2000转染pX459-sgRNA-DDX5至PK-15细胞,经嘌呤霉素压力筛选得到单克隆细胞,通过扩增基因组DDX5序列进行测序和Western-blot鉴定筛选细胞系中DDX5敲除效果。DNA测序结果表明:sgRNA被成功插入载体pX459,并在靶向基因编辑位点产生移码突变;经Western-blot验证,敲除细胞系中DDX5蛋白基本不表达。上述结果表明,本研究采用CRISPR/Cas9技术成功构建了敲除DDX5基因的PK-15细胞系。

• 单位
  长江大学; 动物科学学院; 中国农业科学院兰州兽医研究所; 甘肃农业大学; 家畜疫病病原生物学国家重点实验室