通过易错PCR提高鼠伤寒沙门氏菌丙氨酸消旋酶催化活性

作者：郑豆豆; 罗素亚; 杜穆花; 何广正; 徐书景; 鞠建松^*

来源：微生物学报, 2020, 60(11): 2475-2486.

DOI：10.13343/j.cnki.wsxb.20200033

• 鼠伤寒沙门氏菌
• 丙氨酸消旋酶
• 易错PCR
• 低聚化
• 催化活性

【目的】通过易错PCR技术提高鼠伤寒沙门氏菌中丙氨酸消旋酶的催化活性。【方法】利用易错PCR技术构建丙氨酸消旋酶基因alrSt的突变体文库,采用缺陷菌株UT5028筛选突变体基因,以D-氨基酸氧化酶偶联法检测各突变蛋白的活性,通过凝胶过滤层析法分析酶蛋白寡聚化状态,并采用HPLC检测酶蛋白的动力学参数。【结果】经过易错PCR及定点突变技术最终获得了3个催化活性有所提高的突变体A3V、Y343H和A3VY343H,酶学特性分析发现,与野生型蛋白St Alr相比,突变体Y343H仅对底物L/D-丝氨酸的催化效率略有提高,kcat/Km值分别是StAlr的2.01和3.68倍;而突变体A3V则对底物L/D-丙氨酸或L/D-丝氨酸的Km、kcat和kcat/Km值均有较大幅度的改变,其kcat/Km值分别是StAlr的105.51、97.36、4.63和10.73倍。凝胶过滤层析结果显示,突变体A3V在蛋白含量极低时就呈现出单体和二聚体共存状态,且随着蛋白含量的增加,其向二聚体状态迁移的速率最为明显。【结论】丙氨酸消旋酶StAlr的第3位点是影响其催化活性和低聚合状态的关键位点。

• 单位
  河北师范大学; 生命科学学院