适用于痰液中结核分枝杆菌RNA提取的实验方法

作者：江丽娜; 张梅英; 穆成; 王春花^*

来源：职业与健康, 2019, 35(15): 2050-2056.

DOI：10.13329/j.cnki.zyyjk.2019.0541

• 痰液
• 分枝杆菌
• 甲醇裂解法
• 逆转录聚合酶链反应

目的建立简便有效的确诊肺结核患者痰液中结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)总RNA提取的实验方法,以满足后期荧光定量聚合酶链式反应(PCR)的实验要求。方法选择临床上确诊为结核病的10份痰液标本,为使得总RNA纯度和质量更高,本文在传统的Trizol提取结核分枝杆菌RNA的实验方法上,加入DTT使得痰液均质化,加入RNA酶抑制剂抑制内源性和外源性RNA酶的作用,在醋酸钠作用的弱酸性条件下,观察甲醇裂解细胞壁方法对痰液标本中结核分枝杆菌总RNA抽提的实用性,以稳定的核糖体RNA16s为内参基因,通过荧光定量逆转录PCR方法评价痰液中总RNA提取效果的影响。结果甲醇裂解法和传统Trizol法均能成功提取痰液中的结核分枝杆菌总RNA,总RNA的获得率分别为88.5±0.12,85.65±0.18(P>0.01),纯度A260/280的值分别为1.88±0.06,1.80±0.08,差异无统计学意义(P>0.01),荧光定量PCR检测结果显示,两种方法的RNA提取量均能满足后期RT-PCR实验要求,cDNA获得量甲醇裂解细胞壁方法为16.64±0.54,传统的Trizol法为22.53±0.59,前者优于后者(P<0.01)。结论甲醇裂解法与传统Trizol法都能够从确诊肺结核患者痰液中成功提取总RNA,能满足后续荧光定量PCR的实验要求,但前者优于后者,适用于痰液中结核分枝杆菌RND的提取。