头孢菌素C乙酰化酶高通量筛选方法的改进

作者：唐存多; 史红玲; 张梅; 马莹; 唐青海; 周军事; 姚伦广; 阚云超

来源：中国生物制品学杂志, 2018, 31(02): 188-191.

DOI：10.13200/j.cnki.cjb.001751

• 头孢菌素C
• 乙酰化酶
• 高通量筛选
• 生物催化
• 比色法

目的改进头孢菌素C(cephalosporin C,CPC)乙酰化酶高通量筛选方法,获得催化活性显著提高的突变体。方法基于对二甲氨基苯甲醛(p-dimethylaminobenzaldehyde,p-DAB)与7-氨基头孢烷酸(7-amino cephalosporanic acid,7-ACA)的复合物在405 nm有最大吸收值的原理,采用无菌96孔深孔板对重组菌进行低温低浓度诱导剂诱导表达,再以含溶菌酶和DNase的缓冲液进行菌体裂解,最后以96孔板进行底物的水解和反应终止,经p-DAB显色后,利用酶标仪进行产物的快速定量,以实现CPC乙酰化酶突变体的高通量筛选。结果利用改进的p-DAB比色法从先前建立的突变文库中筛选到2个在13℃下比酶活明显提高的突变子1A10和2G8,其比酶活分别为1.7和2.4 U/mg,较原酶的0.85 U/mg显著提高。在优化的筛选条件下,A405的变化能够准确反映酶活性的大小,确保了该方法筛选结果的可信度。结论改进的p-DAB比色法具有筛选快速,操作简便,筛选通量大及准确度高等优点,能够提高CPC乙酰化酶改造及筛选的效率,为低温CPC乙酰化酶的创制提供了技术支持。

• 单位
  南阳师范学院