本发明公开了一种抗DLL3 scFv,能够特异性结合DLL3;并给出了两套重链和轻链的互补决定区序列。本发明还公开了含有抗DLL3 scFv的抗DLL3 CAR,相关核苷酸序列的质粒、重组慢病毒载体。本发明验证了抗DLL3 CAR-T对DLL3阳性肿瘤细胞的特异性杀伤,及其接受靶细胞刺激后的细胞因子分泌;为开发全人源DLL3抗体及后期DLL3抗体向临床发展奠定了基础。