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摘要
目的探讨表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂厄洛替尼对非增生型糖尿病视网膜病变(NPDR)的治疗作用及机制。方法实验研究。人视网膜Müller细胞(RMC)为Moorfields眼科医院和伦敦大学学院眼科学研究所-Müller 1(MIO-M1)细胞。将MIO-M1细胞分为正常对照、高渗、高糖、高糖+二甲基亚砜(DMSO)、高糖+厄洛替尼 0.5 mmol/L、高糖+厄洛替尼 1 mmol/L和高糖+厄洛替尼 2 mmol/L组。5-乙炔-2′-脱氧尿苷(EdU)掺入实验检测厄洛替尼对高糖条件下MIO-M1细胞增殖的影响;Western印迹检测厄洛替尼对高糖条件下MIO-M1细胞活化标记胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和谷氨酰胺合成酶(GS)蛋白水平的影响。Western印迹检测厄洛替尼对高糖条件下RMC中p75神经生长因子受体(p75NTR)、波形蛋白和细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)蛋白水平的影响。将MIO-M1细胞分为正常对照、高糖、高糖+DMSO和高糖+厄洛替尼1 mmol/L组, 采用细胞免疫荧光染色检测厄洛替尼对高糖条件下EGFR核转位的影响;免疫共沉淀检测厄洛替尼对高糖条件下MIO-M1细胞中EGFR与转录中间因子2(TIF2)之间相互作用的影响。将MIO-M1细胞分为正常对照、高糖、高糖+DMSO、高糖+Myc-DDK空载体、高糖+厄洛替尼、高糖+厄洛替尼+人双调蛋白、高糖+厄洛替尼+TIF2质粒和高糖+厄洛替尼+人双调蛋白+TIF2质粒组, 采用细胞免疫荧光染色检测厄洛替尼通过EGFR/TIF2轴对高糖条件下MIO-M1细胞中EGFR与TIF2结合的影响。采用定量实时逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测通过影响高糖条件下MIO-M1细胞中EGFR与TIF2结合对细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)转录的调节作用。构建小鼠糖尿病视网膜病变(DR)模型, 采用随机数字表法, 按照不同喂养方式, 分为正常对照、DR、DR+DMSO、DR+厄洛替尼 0.25 mg·kg-1·d-1、DR+厄洛替尼 0. 5 mg·kg-1·d-1和DR+厄洛替尼 1 mg·kg-1·d-1组, 共25只小鼠, 每组5只。组织免疫荧光染色检测小鼠RMC活化标记GFAP的表达水平;FITC-葡聚糖注射实验检测厄洛替尼对小鼠DR模型中视网膜血管渗漏的影响。结果与正常对照组(32.4%±3.0%)相比, 高糖组(59.2%±3.8%)RMC中EdU阳性细胞的比例增多(P<0.001)。与高糖组(59.2%±3.8%)相比, 高糖+厄洛替尼1 mmol/L组(37.6%±4.4%)中EdU阳性细胞比例(P<0.001)下降。与正常对照组相比, 高糖组RMC中GFAP表达增高(正常对照组为1, 高糖组为2.27±0.11, P<0.001), GS表达降低(正常对照组为1, 高糖组为0.32±0.03, P<0.001)。厄洛替尼1 mmol/L处理降低高糖条件下RMC中GFAP的表达(分别为1.32±0.13和2.27±0.11, P<0.001), 升高GS的表达(分别为0.71±0.06和0.32±0.03, P<0.001)。高糖+厄洛替尼1 mmol/L组RMC中EGFR与4′, 6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)的共定位比例低于高糖组(分别为52.2%±4.1%和76.4%±5.7%, P<0.001)。用EGF或TIF2抗体沉淀TIF2或EGFR, 两者在高糖条件下相对于正常对照组均升高(正常对照组为1, 高糖组TIF2为2.27±0.20, EGFR为2.17±0.21;均P<0.05), 并且高糖+厄洛替尼组TIF2(1.38±0.10)或EGFR(1.32±0.13)表达低于高糖组TIF2(2.27±0.20)和高糖组EGFR(2.17±0.21)(均P<0.05)。高糖+厄洛替尼组RMC中EGFR与TIF2共定位比例(17.2%±3.9%)及Cyclin D1 mRNA水平(1.32±0.16)均低于高糖组(EGFR与TIF2共定位比例为54.6%±3.7%, Cyclin D1 mRNA水平为2.58±0.19, 均P<0.05), 高糖+厄洛替尼+AREG组、高糖+厄洛替尼+Myc-DDK-TIF2质粒组和高糖+厄洛替尼+AREG+Myc-DDK-TIF2质粒组EGFR与TIF2共定位比例(分别为24.1%±1.9%、26.0%±2.3%、35.3%±2.5%)及TIF2 mRNA水平(分别为1.71±0.16、1.72±0.18、2.20±0.18)均高于高糖+厄洛替尼组(均P<0.05)。相对于正常对照组, 小鼠视网膜组织中GFAP表达在DR组中增高(正常对照组为1, DR组为3.07±0.19, P<0.001), 厄洛替尼0.5 mg·kg-1·d-1处理可(1.73±0.30)显著降低DR组小鼠视网膜中GFAP的表达(P<0.05)。相对于正常对照组(3.97±0.47), DR组(23.13±2.15)荧光素渗漏增加, DR+厄洛替尼组(11.66±1.45)与DR组相比, 渗漏显著降低(均P<0.05)。结论厄洛替尼抑制高糖诱导的人RMC增殖和活化, 抑制RMC中EGFR入细胞核, 抑制RMC中EGFR与TIF2结合, 并且通过抑制EGFR与TIF2相互作用, 降低RMC中Cyclin D1的转录。厄洛替尼抑制小鼠DR模型中RMC的增殖和活化, 改善小鼠视网膜血管渗漏。厄洛替尼通过下调高糖条件下RMC中的EGFR/TIF2/Cyclin D1通路, 抑制RMC的活化和增殖, 从而缓解NPDR的进展。
