基于微滴数字PCR技术建立HBV共价闭合环状DNA的检测方法

作者：田原; 徐玲; 范子豪; 曹亚玲; 张向颖; 陈煜; 段钟平; 任锋^*

来源：临床肝胆病杂志, 2021, 37(08): 1806-1810.

• 乙型肝炎病毒
• DNA,环状
• 微滴数字PCR

目的建立一种用于检测HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)的微滴数字PCR(ddPCR)方法。方法构建HBV cccDNA标准品,利用HBV cccDNA和松弛环状DNA(rcDNA)在结构上存在的差异,设计HBV cccDNA引物和探针,通过扩增HBV质粒得到HBV cccDNA标准品,把梯度稀释后的标准品作为HBV cccDNA检测的模板,建立ddPCR检测方法,并分析此方法的检出限和重复性;收集2017年6月—2020年10月在首都医科大学附属北京佑安医院就诊的20例临床患者的肝组织样本,均诊断为HBV感染,提取样本的DNA,利用质粒安全性ATP依赖的DNA酶(PSAD)进行酶切,得到HBV cccDNA模板,对ddPCR检测方法进行临床样本的评价,并与实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法作对比。计数资料两组间比较采用χ~2检验。结果建立了基于ddPCR的HBV cccDNA检测方法,梯度稀释的HBV cccDNA标准品均能准确检出,检出限为1拷贝/μl,其中1×10~3、1×10~2、1×10~1拷贝/μl标准品的变异系数分别为4.41%、3.98%、5.09%;检测20例临床HBV患者样本的HBV cccDNA,ddPCR检测方法能检出17例,阳性率为85%,qPCR检测方法能检出11例,阳性率为55%,两组比较差异有统计学意义(χ~2=4.286,P=0.038)。结论建立的ddPCR检测HBV cccDNA方法具有较低的检出限和较好的重复性,为进一步的临床检测提供了有效的工具。

• 单位
  北京市肝病研究所; 首都医科大学附属北京佑安医院