Toll样受体4胞外区在毕赤酵母系统的初步表达及鉴定

作者：杨清武; 牟玲; 朱佩芳; 王正国; 蒋建新; 王景周

来源：第三军医大学学报, 2005, (01): 20-23.

• Toll样受体4
• 脓毒症
• 内毒素
• 毕赤酵母

目的　利用毕赤酵母系统对Toll样受体 4(Toll likereceptor 4,TLR4)胞外区进行初步表达及鉴定 ,为相关研究奠定基础。方法　用PCR获得扩增TLR4胞外区DNA ,经序列分析后 ,插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体中 ,构建pPIC9K/TLR4胞外区的重组质粒 ;转化酵母宿主菌GS115后 ,G418筛选多拷贝转化子 ;菌落PCR鉴定后 ,摇菌培养 ,1%甲醇诱导表达。SDS PAGE分析表达产物 ,并利用Westernblot法鉴定。结果　PCR扩增的TLR4胞外区基因序列与GenBank数据库中的序列一致 ,构建的重组质粒经酶切及测序证实 ,成功构建了pPIC9K/TLR4胞外区的重组质粒。经过G418筛选后 ,共获得 2 0 0个高拷贝转化子 ,菌落PCR鉴定其中 5个克隆 ,能扩增出特异的TLR4胞外区基因片段 ,表明TLR4胞外区基因完全整合到毕赤酵母中 ;SDS PAGE分析显示 ,表达产物以可溶性分子形式存在于上清中 ,薄层凝胶扫描分析显示诱导表达 4d的表达量达上清的 5 0 3 5 % ,Westernblot分析表明表达蛋白能与TLR4单抗结合。结论　利用毕赤酵母系统成功地对TLR4胞外区进行了表达及鉴定 ,为进一步筛选高表达菌株、蛋白纯化、功能研究奠定基础。

• 单位
  第三军医大学大坪医院; 神经内科