基于CRSIPR/Cas9技术构建凝血因子8基因敲除小鼠模型及表型验证

作者：王海杰; 王成稷; 郭洋; 王云; 陈艳娟; 梁敏; 王珏; 龚慧; 沈如凌^*

来源：生物技术通报, 2022, 38(10): 273-280.

DOI：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-1564

• 凝血因子8(F8)
• CRISPR/Cas9
• 基因敲除
• 血友病A

基于CRISPR/Cas9技术构建凝血因子8(F8)基因敲除小鼠模型并对其表型进行初步验证。针对F8基因外显子1非编码区和外显子26下游序列设计sgRNA靶位点，体外转录获得sgRNA，与编码Cas9的mRNA混合后通过受精卵显微注射方法获得F0代阳性敲除小鼠，通过繁育及基因型鉴定获得F8基因敲除纯合子小鼠(F8-/-小鼠)；通过逆转录PCR(RT-PCR)检测主要组织中F8基因在mRNA水平的表达情况，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血浆中F8基因在蛋白水平的表达情况；通过活化部分凝血活酶时间检测(APTT)和纤维蛋白原含量(FIB)测定实验检测F8基因敲除后小鼠凝血功能情况。PCR及测序结果表明F8基因在小鼠基因组中被成功敲除；RT-PCR 和ELISA检测结果显示，F8-/-小鼠中F8在mRNA和蛋白水平上表达均显著低于野生型小鼠(WT小鼠)(P<0.000 1，P<0.01)；APTT、FIB和滴血实验检测结果显示，F8-/-小鼠血浆凝固时间显著高于WT小鼠(P<0.05)，F8-/-小鼠存在严重凝血障碍表型，给予人凝血因子Ⅷ后凝血可恢复到正常水平。利用 CRISPR/Cas9技术成功构建F8基因敲除小鼠模型并初步验证其表型，证实该小鼠F8基因的缺失可以导致凝血功能障碍。

• 单位
  上海实验动物研究中心