免疫磁珠及无血清悬浮培养法对肝癌干细胞的分离与富集

作者：陈克霏; 刘俊; 李波

来源：中国普外基础与临床杂志, 2017, 24(08): 946-952.

• 肝癌干细胞
• 免疫磁珠分选
• 流式细胞术
• 无血清悬浮培养

目的评估免疫磁珠分选技术分选肝癌干细胞的效率。方法 (1)CD90的表达检测:采用免疫组织化学染色SP法检测8例正常肝组织、58例肝癌及其癌旁组织中CD90的表达。(2)细胞系筛选:将Huh-7、MHCC97-H、SMMC-7721及Bel7402细胞系分为空白对照组和实验组(细胞数量均为5.5×10~5个,均为1孔),实验组细胞中加入5μL CD90~–PE抗体,空白对照组加入5μL CD90~–无荧光抗体。采用流式细胞术检测4种细胞系空白对照组和实验组的CD90~+细胞比例,以筛选细胞。(3)免疫磁珠分选:将Huh-7和MHCC97-H细胞系分别进行磁珠标记后进行磁珠分选。收集流经磁珠分选柱(MS)后的细胞悬液1 m L,作为CD90~–组;将MS移出磁场区域,加入1 m L PBS缓冲液快速冲洗至离心管中,标记为CD90~+组;以未分选细胞作为空白对照组(加入CD90~–无荧光抗体)和未分选实验组(加入CD90~–PE抗体)。对Huh-7细胞系进行二次分选。采用流式细胞仪检测4组细胞中的CD90~+细胞比例。(4)无血清培养和含血清培养:将Huh-7细胞接种到无血清培养基专用6孔板中进行培养(无血清和含血清悬浮培养均为1孔),1周后采用流式细胞仪检测无血清培养和含血清培养后细胞中的CD90~+细胞比例。结果 (1)正常肝组织中CD90的表达阳性率为0(0/8),肝癌组织为65.5%(38/58),癌旁组织为20.7%(12/58)。肝癌组织中CD90的表达阳性率较正常肝组织(χ2=6.78,P<0.05)和癌旁组织高(χ~2=20.83,P<0.05)。(2)Huh-7、MHCC97-H、SMMC-7721及Bel7402细胞系中实验组的CD90~+细胞比例分别为0.851%、1.090%、2.710%及4.050%,空白对照组分别为0.241%、0.688%、1.890%及2.080%,故选择Huh-7和MHCC97-H细胞系进行下一步的免疫磁珠分选。(3)Huh-7细胞经一次分选后:未分选空白对照组的CD90~+细胞比例为0.241%,未分选实验组为0.851%,CD90~–组为0.574%,CD90~+组为1.100%;二次分选后:未分选空白对照组的CD90~+细胞比例为0.032%,未分选实验组为0.961%,CD90~–组为0.426%,CD90~+组为9.700%。结论正常肝组织实质细胞不表达CD90,肝癌组织高表达CD90。肝癌细胞系Huh-7和MHCC97-H中存在少量的CD90~+细胞,免疫磁珠分选法能明显提高CD90~+细胞比例,但作用十分有限。无血清悬浮培养法对富集CD90~+细胞无明显作用。

• 单位
  四川大学华西医院