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摘要
目的 研究槲皮素对过氧化氢(H2O2)引起的神经细胞损伤的潜在保护作用及机制。方法 为模拟脊髓损伤后神经细胞出现的缺氧损伤，使用不同浓度的H2O2(0,100,200,300,400,500,600,700μmol/L)对SH-SY5Y细胞进行干预8 h,采用CCK-8试剂检测细胞存活率，并结合显微镜下观察，摸索H2O2造模的最佳浓度。使用不同浓度(10,25,50,100,200μmol/L)的槲皮素(quercetin, QUE)对SH-SY5Y细胞进行预处理4 h,再予以H2O2造模处理，通过CCK-8法检测细胞存活率。使用生物信息技术预测槲皮素改善脊髓损伤后神经细胞缺氧损伤的可能作用靶点，首先在TCMSP数据库中筛选槲皮素的作用靶点，同时在5个疾病相关数据库检索与脊髓损伤相关靶点基因，筛选获得槲皮素和脊髓损伤的共同靶点，对靶点蛋白进行PPI蛋白互作分析，并利用Cytoscape中的cytoNCA进行关键靶点的筛选。为进一步验证预测的靶点是否参与槲皮素对神经细胞缺氧损伤的改善作用，将SH-SY5Y细胞分为control组、H2O2组(400μmol/L H2O2作用8 h)以及QUE组(100μmol/L QUE预处理4 h后再予以H2O2干预),使用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测不同分组p53蛋白的表达水平。为验证p53蛋白在槲皮素干预H2O2诱导的神经细胞损伤中的作用，使用慢病毒感染SH-SY5Y细胞以构建p53蛋白敲低的细胞稳转株以及病毒空白载体对照(shRNA-NC),将携带慢病毒的SH-SY5Y细胞分为shRNA-NC组、shRNA+H2O2组和shTP53+H2O2组，shRNA+H2O2组在感染病毒空载的基础上予以H2O2干预，shTP53+H2O2组在成功感染p53敲低慢病毒的基础上再给予H2O2处理8 h,利用CCK-8检测不同分组细胞的存活率变化。结果 300,400,500,600,700μmol/L H2O2对SH-SY5Y细胞造成不同程度的损伤，细胞存活率随着H2O2浓度的升高而降低(P<0.05),浓度为400μmol/L的H2O2持续作用8 h能够造成SH-SY5Y细胞近半数死亡(P<0.001),此时镜下观察显示：部分细胞形态严重损伤并有少量细胞碎片。使用50,100,200μmol/L槲皮素对细胞进行预处理可减少H2O2诱导的神经细胞死亡，提高细胞存活率(P<0.05)。通过生物信息技术分析获取槲皮素治疗脊髓损伤的作用靶点有91个，使用Cytoscape软件中的cytoNCA筛选槲皮素作用的关键靶点为p53。Western blot检测结果显示：与control组相比，H2O2组p53蛋白表达显著升高(P<0.05),而与H2O2组相比，QUE组p53蛋白表达则明显下降(P<0.001)。CCK-8结果显示，与shRNA-NC组相比，shRNA+H2O2组细胞存活率明显降低(P<0.001);而与shRNA+H2O2组相比，shTP53+H2O2组的细胞存活率则明显升高(P<0.001)。结论 槲皮素通过抑制p53蛋白的表达减少H2O2诱导的神经细胞死亡。
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单位第一临床学院; 山西医科大学; 基础医学院; 山西省人民医院; 山西医科大学第三医院; 山西中医药大学
